一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪瘟（CSF)是国际动物卫生组织（OIE)和中国的A类法定传染病，是我国强制性免 疫的重大动物疫病之一，是危害我国养猪业的"第一杀手"。猪瘟是由猪瘟病毒引起的，无法 用药物进行控制，疫苗免疫是最有效的办法。
[0003] 目前国内外市售的猪瘟疫苗主要有猪瘟脾淋苗、猪瘟细胞苗以及猪瘟亚单位疫 苗，但市场上猪瘟疫苗的主流产品仍然是猪瘟脾淋苗和猪瘟细胞苗。作为疫苗中的经 典-精制猪瘟脾淋源活疫苗仍具有不可替代的作用。
[0004] 猪瘟脾淋源活疫苗选用中国猪瘟兔化弱毒株（C株)，该疫苗株能激发机体快速产 生免疫力、遗传稳定、毒力不返强，是国际上公认的目前世界上最为安全有效的弱毒疫苗 株。采用该毒株接种优良家兔，收获感染家兔的脾脏制成乳剂，与冻干保护剂混匀后经过冷 冻真空干燥制成猪瘟脾淋源活疫苗。
[0005] 目前市场认为猪瘟脾淋源活疫苗免疫效果不理想，对猪瘟脾淋活疫苗的认识仍存 在误区，这主要和目前国内猪瘟脾淋源活疫苗使用方法不当、混合感染猪只免疫后应激过 大，以及质量参差不齐等情况有关。
[0006] 氨基酸，是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的 基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。维生素又名维他命，通俗来讲，即 维持生命的物质，是维持机体生命活动必须的一类有机物质，也是保持机体健康的重要活 性物质。维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂， 不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有 辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调 节机体正常代谢的重要物质。在体内硒和维生素 E协同，能够保护细胞膜，防止不饱和脂肪 酸的氧化。
[0007] 多糖是中药活性成分之一，大量研宄表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作 为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的 各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶 活性和抑制脂质过氧化的能力。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种接种家兔用猪瘟病毒 辅助液及其制备方法的技术方案。
[0009] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于每1000 ml磷酸缓冲液中含 有以下重量配比的组分：维生素组合6~10g、氨基酸组合3~5g、复方中药多糖10~30g、 亚硒酸钠 O~IOmg ; 所述的氨基酸组合包括蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸； 所述的维生素组合包括维生素 A、维生素 D、维生素 E和维生素 K ; 所述的复方中药多糖由云芝、角叉藻、天麻、芍药、桃仁提取得到。
[0010] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于该辅助液的PH为7. 2~7. 6。
[0011] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的磷酸缓冲液由氯化 钠6~10g，氯化钾0. 05~0. 5g，磷酸氢二钠1~I. 2g，磷酸二氢钾0. 05~0. 5g，氯化钙 0. 05~0. 2g，含6个结晶水的氯化镁0. 05~0. 2g溶于1000 ml双蒸水中得到。
[0012] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的每1000 ml磷酸缓冲 液中含有以下重量配比的组分：维生素组合7~9g、氨基酸组合3. 5~4. 5g、复方中药多糖 15~25g、亚硒酸钠2~8mg。
[0013] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的氨基酸组合中含有： 蛋氨酸10~15%、赖氨酸20~30%、色氨酸5~20%、谷氨酸10~30%、甘氨酸5~30%和 丙氨酸5~30%。
[0014] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的氨基酸组合中含有： 蛋氨酸12~14%、赖氨酸22~26%、色氨酸10~15%、谷氨酸15~25%、甘氨酸10~20% 和丙氛酸15~25%。
[0015] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的维生素组合中含有： 维生素 A 10~20%、维生素 D 15~30%和维生素 E 15~45%、维生素 K 25~60%。
[0016] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的维生素组合中含有： 维生素 A 12~18%、维生素 D 20~25%和维生素 E 20~35%、维生素 K 30~40%。
[0017] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的复方中药多糖按以下 步骤制得： a、 按云芝20~40份、角叉藻10~30份、天麻10~30份、苟药5~20份和桃仁5~ 20份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴 至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000 Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上 清； c、 将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； d、 用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按通过活性炭柱进行内毒素吸附，收集滤出液； e、 将d中上滤出液通过sevag法除去蛋白； f、 将e中中药多糖进行真空冷冻干燥制得复方中药多糖。
[0018] 所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液的制备方法，其特征在于包括以下工艺步 骤： 1) 磷酸缓冲溶液的配制：称取氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钙，含6 个结晶水的氯化镁溶于双蒸水中，无菌条件下通过0. 22 μ m滤膜，过滤除菌备用； 2) 复方中药多糖的制备 a、称取云芝份、角叉藻份、天麻份、芍药份和桃仁份，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再 加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10 分钟搅拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000 Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上 清； c、 将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； d、 用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按通过活性炭柱进行内毒素吸附，收集滤出液； e、 将d中上滤出液通过sevag法除去蛋白； f、 将e中中药多糖进行真空冷冻干燥制得复方中药多糖； 3)接种家兔用病毒辅助液配制：按比例称取氨基酸组合、维生素组合、复方中药多糖和 亚硒酸钠，溶解于步骤1)制得的磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至7. 2~7. 6 之间，无菌条件下通过0. 22 μ m滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用。
[0019] 本发明具有积极有益的效果： (1)本发明所制备的辅助液，在接种家兔时能够将病毒送至易感器官，减少接种损失， 提尚接种成功率。
[0020] (2)本发明所制备的辅助液，接种家兔，可提高家兔感染的稳定性，减少了批次间 差异，确保成品疫苗批次间稳定性，提高了疫苗质量。
[0021] (3)本发明所制备的辅助液接种家兔后，可特异性的提高猪瘟病毒在家兔体内的 增殖密度，比现有技术相比提高了病毒滴度5~10倍。
[0022] (4)本发明所制备的辅助液，接种家兔后发现所收获的脾脏重量稍有增加，与现有 技术相比，所获得的脾脏重量增加了 15%~40%。
【具体实施方式】
[0023] 为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0024] 实施例1 一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，该病毒稀释液每1000 ml磷酸缓冲液中含有：氨基酸 组合3g (其中蛋氨酸0. 3g、赖氨酸0. 6g、色氨酸0. 5g、谷氨酸0. 6g、甘氨酸0. 6g和丙氨酸 0. 4g)、维生素组合6g(其中维生素 A 1.2g、维生素 D 1.6g和维生素 E 1.4g、维生素 K 1.8)、 复方中药多糖l〇g、亚硒酸钠3mg，该辅助液pH为7. 4。
[0025] -种接种家兔用猪瘟病毒辅助液的制备方法，其步骤是： (1)磷酸缓冲溶液的配制：按上述磷酸盐缓冲液配方准确称取氯化钠8g，氯化钾0. 2g， 磷酸氢二钠 I. 15g，磷酸二氢钾0. 2g，氯化钙0. lg，含6个结晶水的氯化镁0.1 g溶于1000ml 双蒸水中，无菌条件下通过〇. 22 μ m滤膜，过滤除菌备用。
[0026] (2)复方中药多糖的制备 a、按比例称取云芝30份、角叉藻20份、天麻20份、芍药10份和桃仁15份，切碎、洗净 后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小 时，熬制过程中每10分钟搅拌一次。
[0027] b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000 Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集 上清。
[0028] c、采用公知的醇沉法，将b中上清进行醇沉，沉淀为粗制中药多糖。
[0029] d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行 溶解，溶解后，按通过活性炭柱进行内毒素吸附，收集滤出液； e、 将d中上滤出液通过sevag法除去蛋白； f、 将e中中药多糖进行真空冷冻干燥制得复方中药多糖； (3)接种家兔用病毒稀释液配制：按上述优选稀释液组分数准确称取蛋氨酸0. 3g、赖 氨酸0. 6g、色氨酸0. 5g、谷氨酸0. 6g、甘氨酸0. 6g和丙氨酸0. 4g、维生素 A I. 2g、维生素 D 1.6g和维生素 E 1.4g、维生素 K 1.8、复方中药多糖10g、亚硒酸钠3mg、按比例溶解于步 骤（1)中的1000 ml磷