一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术疫苗制备领域，具体涉及到一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒 纯化及其疫苗制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科（circoviridae)圆 环病毒属成员，是迄今为止发现的最小动物病毒。1974年，德国学者Tisch等首次在 PK15 (ATCC-CCL31)的细胞系培养基中发现了一种细胞污染物，分析表明该污染物为单链共 价环状的无囊膜的二十面体对称的DNA病毒，并将其命名为猪圆环病毒（PCV)。该病毒虽然 广泛传播，但是对猪群不具有致病性，也不引起临床症状和病理变化。随后研宄人员在患有 断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS)的猪中分离出了对猪具有致病性的PCV病毒，并将其命 名为PCV2,而将之前不具有致病性的PCV命名为PCVl。
[0003] PCV2引起的疾病范围非常广泛，不但能够导致母猪出现繁殖障碍，还能够使断奶 仔猪和育肥猪出现呼吸道疾病、猪皮炎肾病综合征（PDNS)、猪呼吸道疾病综合症（PRDC)、 增生性坏死性肺炎（PNP)等相关疾病。所以，这些与PCV2相关的疾病被有些学者统称为猪 圆环病毒病（PCVDS)。在养猪业蓬勃发展的中国PCV2感染情况相当普遍。据国内部分地区 流行病学调查结果显示：PCV2 -般感染率为26. 03-77. 46%，部分省份和地区抗体或病毒 核酸阳性率高达100%。PCV2常与猪瘟、猪蓝耳病等病原混合感染，有证据显示PCV2感染 使机体继发感染其他传染病的几率增加，这一现象可能是由于PCV2感染引起猪的免疫抑 制所导致的。
[0004] 自从加拿大首次发现PMWS以来，出现了一系列与PCV2相关的疾病和综合征。疫 苗免疫被认为是针对这一病毒的主要防治手段。迄今为止，已注册上市的PCV2疫苗主要是 灭活疫苗和亚单位疫苗。其中灭活疫苗由于不能在动物体内复制，因此对机体刺激时间比 较短，如果想要获得持久免疫力就需要多次重复接种。
[0005] PCV2基因组含有11个开放阅读框（orf)，其中orfl与orf2是其最大的两个阅读 框。现已证实，orfl编码与病毒复制相关的Rep蛋白，该蛋白氨基酸序列相当保守，是PCVl 和PCV2产生抗原交叉性的主要原因；orf2编码的Cap蛋白是圆环病毒的结构蛋白，也是圆 环病毒的主要抗原蛋白。由于亚单位疫苗具有产量高、纯度高、安全性好等优点，因此，Cap 蛋白成为研制PCV2亚单位疫苗的明星抗原。至今为止，Cap蛋白在多种表达系统中均得到 表达。由于杆状病毒表达系统具有宿主范围窄、极易灭活、对外源基因克隆容量大、具有完 整的翻译后加工修饰系统等优势，因此，本发明采用昆虫杆状病毒表达系统表达猪圆环病 毒2型的Cap蛋白。为了使其能够更加适应昆虫杆状病毒表达系统、提高其蛋白产量，本发 明在不改变氨基酸序列的前提下对编码Cap蛋白的氨基酸密码子进行优化，经人工改造的 Cap蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明显示，经过氨基酸密码子优化的Cap蛋白 在昆虫细胞中高效大量表达，产量达到l〇〇mg/L。
[0006] Cap蛋白能够自我组装成为病毒样颗粒结构（VLPs)，目前，对于病毒样颗粒的纯 化方案通常是使用蔗糖密度梯度离心的方式，但是采用这种方式存在耗时长、纯化效率低 等缺点。为了解决上述问题，本发明提供了一种快速简便地从细胞裂解物中纯化病毒样颗 粒的方案，采用本方案仅需要一步凝胶过滤层析即可得到纯度大于90%的病毒样颗粒，不 但节省了大量时间还会因为简化纯化步骤从而减少蛋白在纯化中间环节中所造成的损失。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的旨在提供一种能够预防猪圆环病毒2型感染的病毒样颗粒疫苗。
[0008] 本发明提供一种利用昆虫杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫 苗的方法。
[0009] 本发明提供一种简便的病毒样颗粒纯化方法。
[0010] 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括下述步骤：
[0011] 1)将人工改造的编码猪圆环病毒2型（PCV2)Cap蛋白的orf2基因克隆到昆虫杆 状病毒表达系统中得到重组杆状病毒BV-PCV2-CAP。
[0012] 2)将重组杆状病毒BV-PCV2-CAP进行扩大培养，通过凝胶过滤层析纯化得到目的 蛋白。
[0013] 3)将猪圆环病毒2型Cap蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到猪圆环病毒 2型病毒样颗粒疫苗。
[0014] 具体地，1)所述的重组的杆状病毒BV-PCV2-CAP构建方法为将优化的编码猪圆 环病毒2型Cap蛋白的〇rf2基因克隆到载体pFastBac?/NT-TOPO?i中，得到重组质粒 Inv-TOPO_N-PCV2-CAP，将重组质粒转化到大肠杆菌DHlOBac?感受态细胞中产生重组杆状 病毒质粒（bacmid-PCV2-CAP)，最后将重组杆状病毒质粒转染sf9细胞产生重组杆状病毒 BV-PCV2-CAP。
[0015] 2)所述扩大培养为：重组杆状病毒质粒bacmid-PCV2_CAP转染处于对数期的sf9 细胞（细胞密度为1. 5-2. 5 X 106/ml)得到Pl代病毒；两代扩增后以P3代病毒感染处于对 数期的昆虫细胞High five进行扩大培养。
[0016] 2)所述回收纯化为：离心收集2)所述的扩大培养细胞，以冰预冷PBS(含蛋白酶 抑制剂）重悬细胞，使用细胞均质仪Avestin将细胞悬液裂解为较澄清的液体。12, OOOrpm 离心30min后用0. 45 μ m滤膜去除细胞碎片。使用凝胶过滤层析方法对细胞裂解上清中的 病毒样颗粒进行纯化。
[0017] 3)所述重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA 201VG。
[0018] 猪圆环病毒2型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，经人工改造的Cap 蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0019] 如上所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗在防控猪圆环病毒中的应用。
【附图说明】
[0020] 图 I. pFastBac?/NT-TOPO?质粒图谱。
[0021] 图 2.重组质粒 Inv-T0P0-N-PCV2-CAP PCR 鉴定结果。M.DNA Marker DL5,000 ; 1.重组质粒Inv-T0P0-N-PCV2-CAP PCR电泳结果；2.阴性对照。
[0022] 图 3. bacmid-PCV2-CAP PCR 鉴定结果。M. DNA Marker DL5, 000 ;1· M13 引物 PCR 鉴 定重组杆状病毒质粒bacmid-PCV2_CAP结果。
[0023] 图 4. Western blot (anti-His)鉴定 Cap 蛋白表达。+·阳性对照；M. Prestained Protein Ladder ;CAP. Cap 细胞裂解物。
[0024] 图5.凝胶过滤层析色谱图以及SDS-PAGE结果。
[0025] 图6. Cap蛋白透射电镜观察结果。
[0026] 图7. Cap蛋白免疫猪后抗体效价监测结果。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1表达载体的构建
[0028] I. IPCR扩增引物（平末端连接）： 上游引物：5' -ACCTACCCCCGTAGAAGATA-3' 下游引物：5 ' -TTAGGGGTTCAGGGTGGGGGC-3 '
[0029] 加样体系为（50 μ 1):
[0030] PCR扩增程序：
【主权项】
1. 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： I. 1猪圆环病毒2型的衣壳蛋白Cap其特征在于如（a)或（b)的蛋白质： (a) 由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸组成的蛋白质； (b) 在（a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有猪 圆环病毒2型衣壳蛋白Cap抗原性的由（a)衍生的蛋白质。 1. 2将人工改造的编码猪圆环病毒2型（PCV2) Cap蛋白的orf2基因克隆到昆虫杆状病 毒表达系统中得到重组杆状病毒BV-PCV2-CAP ; 1. 3将重组杆状病毒BV-PCV2-CAP进行扩大培养，通过凝胶过滤层析纯化得到目的蛋 白； 1. 4将Cap蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到PCV2病毒样颗粒疫苗； 其中猪圆环病毒2型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，经人工改造的Cap 蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根据权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于，1. 2所述的重组的杆状病毒 BV-PCV2-CAP构建方法为：将优化的编码猪圆环病毒2型（PCV2)Cap蛋白的orf2基因克隆 到载体pFastBac?/NT-TOPO?中，得到重组质粒Inv-T0P0-N-PCV2-CAP，将重组质粒转 化到大肠杆菌DHlOBacTM感受态细胞中产生重组杆状病毒质粒（bacmid-PCV2-CAP)，最后 将重组杆状病毒质粒转染sf9细胞产生重组杆状病毒BV-PCV2-CAP。
3. 根据权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于，1. 3所述的扩大培养为：重组杆 状病毒质粒bacmid-PCV2-CAP转染处于对数期的sf9细胞（细胞密度为1. 5-2. 5 X 106/ml) 得到Pl代病毒；两代扩增后以P3代病毒感染处于对数期的昆虫细胞High five进行扩大 培养。优选地，所述杆状病毒感染复数（MOI)为0. 5-10,进一步优化为2 ;优选地，所述昆虫 细胞High five细胞密度为1. 5-2. 5 XlOfVml，进一步优化为I. 5 XlOfVml ;优选地，所述培 养时间为96h。
4. 根据权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于，1. 3所述的蛋白纯化方法为：离 心收集1. 3所述的扩大培养细胞，以冰预冷PBS (含蛋白酶抑制剂）重悬细胞，使用细胞均 质仪Avestin将细胞悬液裂解为较澄清的液体。12, OOOrpm离心30min后用0. 45pm滤膜去 除细胞碎片。使用凝胶过滤层析方法对细胞裂解上清中的病毒样颗粒进行纯化。优选地但 不限于，所述的凝胶过滤柱为把1〇3(116/6〇8即61(161 200?6。优选地但不限于，所述的缓冲 液为 PBS，pH7.4。
5. 根据权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于，1. 4所述佐剂为油乳佐剂。优选 地但不限于，使用的佐剂为ISA201VG。优选地，所述的Cap蛋白与佐剂ISA201VG按推荐比 例混合乳化。
6. 权利要求1所述Cap蛋白表达系统包括但不限于昆虫细胞、大肠杆菌、酵母以及哺乳 动物细胞等。
7. 权利要求1-5任一项所述方法制备得到的猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗。
8. 权利要求5所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗在防控猪圆环病毒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗的制备方法和应用。本发明所提供的制备方法包括以下步骤：将人工优化的编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因克隆到杆状病毒载体中，通过转染昆虫细胞sf9获得重组杆状病毒。利用重组杆状病毒感染high five细胞，使Cap蛋白在细胞中大量表达。本发明还公开了一种快速简便纯化病毒样颗粒的方法。本发明所提供的纯化方法包括以下步骤：离心收集high five细胞，以冰预冷PBS重悬细胞，使用细胞均质仪将细胞悬液裂解为较澄清的液体。通过凝胶过滤层析方法对病毒样颗粒进行纯化。使用本发明所提供的方法能够快速从复杂的细胞裂解液中特异的纯化到病毒样颗粒蛋白，纯度达到90％以上。
【IPC分类】C12N15-866, C12N7-02, A61P31-20, C12N15-34, A61K39-12, C07K14-01
【公开号】CN104873966
【申请号】CN201510193437
【发明人】宣春玲, 钱泓, 吴有强, 吕朋, 吴素芳, 张屹峰, 查银河, 汪正亮
【申请人】浙江海隆生物科技有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月20日