复合细胞电喷技术的纳米纤维支架制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种复合细胞电喷技术的纳米纤维支架制备方法，属于组织工程纳米纤维支架制备与修复领域。
【背景技术】
[0002]组织工程利用生物制造技术将种子细胞接种在可降解的生物支架材料上进行体外培养或植入体内组织器官缺损部位，随着生物材料的逐渐降解和吸收，细胞不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成具有正常结构和功能的活体组织，完成对组织的修复和再造。
[0003]近年来，由于纳米材料研宄的迅速发展，使得人们对静电纺丝技术的有了更进一步的研宄，和拉升、相分离等方法相比，静电纺丝技术已经成为制取纳米纤维支架最重要最有效的方法。静电纺丝技术制备出的纳米纤维支架可以提供较高的孔隙率以及较好的连通性，与细胞在体内的生存环境较为类似，因此在医学上，纳米纤维支架得到了也越来越广泛的应用。目前构建组织工程纳米纤维支架的常见方法如下:
其一:在制备出来的纳米纤维支架上直接接种细胞。这种方法接种出来的含细胞的纳米纤维支架主要存在以下缺陷:(I)支架的上细胞的分辨率比较低，致部分支架部位细胞数目较多，部分地方细胞数目较小，而分布数目少的部分新生组织的生长速度会比较缓慢；
(2)支架的细胞吸附率较低，支架在逐渐讲解时有可能导致细胞的脱落，使得纤维材料外露，而组织相容性差的材料还有可能直接导致纤维素的沉积和血栓的形成；(3)细胞通过支架的由表面向内迀移生长，这种单方向生长与自然组织细胞的三维均衡环境相差很远，影响了细胞-细胞、细胞-支架的相互作用，以及组织的发育；(4)只能制作出尺寸较小的支架，并且由于外部营养物质的渗透能力有限，支架中心的部位细胞获得营养成分较少，从而导致细胞营养不良，生长缓慢，无法形成血管化。
[0004]其二:采用细胞悬浮液与纤维支架材料进行混合同时通过电纺丝设备纺丝出来形成含细胞的纳米纤维支架。这种方法从一定意义上解决了直接接种支架存在的一些问题，但是也不可避免的存在一定的不足:细胞在与材料的混合过程中，由于采用人工方法手动进行混合，可能无法使细胞混合均匀，从而难以形成均一的含细胞的混合溶液，而且在电纺丝过程中，细胞与材料同时纺出，生物材料与细胞之间的相互作用会对细胞造成一定的损伤。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对以上出现的问题，提出一种复合细胞电喷技术的纳米纤维支架制备方法，其制备出来的复合支架能够保持细胞分布的高分辨率，并且能够有效进行营养物质的传输。制备方法为利用高压电源同时电喷细胞悬浮液以及可降解的高分子生物材料，以构建出具有生物活性的且细胞具有高分辨率的纳米纤维支架，为组织修复技术提供一种更为行之有效的技术方法。
[0006]为了实现上述的目的，本发明采用如下技术方案: 一种复合细胞电喷技术的纳米纤维支架制备方法，聚合物材料和细胞悬浮液分别通过不同的电喷装置同时喷出制备而成，该方法包括以下步骤:
步骤一，首先取20ml左右去离子水于磁力搅拌器上加热至沸腾状态，然后采用电子天平称取1.86g水溶性的可降解的高分子聚合物，在均匀搅拌情况下将加热的去离子水缓慢加入到聚合物材料中至20g，至充分溶胀后升温到80~100°C以加速溶解，直至充分溶解完毕；待取得均一的高分子溶液后，将溶液放置于震荡球磨机中研磨90分钟；
步骤二，将研磨好的高分子溶液在120°C的蒸汽压力锅中进行高温消毒半小时，消毒之后将高分子溶液吸入1ml注射器中；
步骤三，将人的细胞用4ml的含0.25%胰蛋白酶的胰蛋白酶溶液消化后再用同体积的细胞培养液进行中和，并将所得的混合溶液收集于50ml的离心管中，lOOOr/min离心5分钟，去除上清液，并重新加入5ml细胞培养液，采用移液枪吹打形式使细胞分布均匀，形成细胞悬浮液，并将所得的细胞悬浮液吸入1ml注射器中；
步骤四，采用的电喷设备含有两个电喷装置，分别将高分子聚合物溶液和细胞悬浮液放置于不同的两个电喷装置上，两个电喷装置平行放置，并在注射器针头上分别加上8KV、14KV的直流电压，接收装置采用圆形不锈钢板，针头和接收板之间的距离为15cm，并将接收板连接高压电源的负极电位；微量泵实现将高分子聚合物溶液和细胞悬浮液分别以500ul/min和300ul/min的稳定流量进行供料，持续电喷2小时，即可得到采用复合电喷方法制备而成的含细胞的纳米纤维支架。
[0007]优选地，所述步骤一的水溶性可降解高分子聚合物为聚乙烯醇(PVA)。
[0008]优选地，所述步骤三的细胞为人的脂肪干细胞或骨髓间充质干细胞。
[0009]优选地，所述步骤四所采用的电喷设备包含双路高压电源与双路微量泵。
[0010]本发明与现有技术相比较，具有以下显而易见的突出实质性特点和显著优点:
一，本发明将活细胞的悬浮液与高分子聚合物材料通过不同的电喷装置同时电喷在同一个接收板上，使得细胞能够均匀单一的分布在高分子聚合物材料形成的纳米纤维支架上，显著提高了细胞在支架上的分辨率；
二，由于细胞与支架同时制备，所以支架内部与外部存在相同的细胞，有利于细胞之间的交互作用，便于细胞的迀移，同时也有利于支架外部营养物质的传输。
[0011]三，设备配合上位机进行操作，简单易行，同时也极大地提高了复合支架制备的效率，减少了支架制备时间。
【附图说明】
[0012]图1为制备复合细胞电喷技术的纳米纤维支架的系统的示意图。
【具体实施方式】
[0013]本发明的优选实施例结合附图详述如下:
如图1所示为制备复合细胞电喷技术的纳米纤维支架的系统示意图。其中:计算机连接PMAC控制卡，控制卡连接双路高压电源、第一微量泵和第二微量泵，不锈钢接收板放置于绝缘垫板上，位置处于两个微量泵下方正中间部位，第一注射器连接第一微量泵，第二注射器连接第二微量泵，高压电源的两个正极分别加载在第一注射器的针头和第二注射器的针头上，负极加载在圆形的不锈钢接收板上。第一注射器内设有细胞悬浮液。第二注射器内设有聚合物溶液。
[0014