细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨及其制备方法

文档序号:8550695阅读:273来源:国知局
细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学工程中利用组织工程技术构建人造组织/器官技术领域,具体是一种细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨及其制备方法。
【背景技术】
[0002]我国每年约有350万人因不同原因出现骨缺损,骨手术移植约为150万例,对替代骨的需求量非常大,尤其是大骨骼损伤的替代骨。随着组织工程技术的快速发展,在体外构建具有成骨传导性和成骨诱导性的人造替代骨是解决这一需求的重要途径。骨架材料在组织工程骨构建中起着至关重要的作用,相比于其他合成材料,天然细胞外基质(ECM)材料由于其以下特点:1.优异的生物相容性;2.最接近于体内细胞生长微环境的三维结构;3.为细胞生命活动提供了各种活性分子,一直被认为是理想的组织工程材料。猪小肠黏膜下层(SIS)是目前研宄最多的天然细胞外基质材料,已通过美国FDA批准,被广泛用来构建人造膀胱、人造尿道、人造食道、人造血管和人造皮肤等软组织。SIS材料骨架成分胶原蛋白(collagen)已经被广泛用来作为骨架材料和药物载体用于骨组织工程。SIS相比于胶原有两大优点:1.SIS是个天然的药物库,它保留了许多有利于骨再生的生物活性分子;2.SIS在取材上更加便利,成本也要远低于胶原。国内外用SIS材料作为骨组织工程骨架材料报道已有一些,但是主要有两个问题使之无法进一步推广使用:1.SIS材料机械强度较低,无法在植入体内后提供足够机械支撑;2.成骨诱导性的不足。如果能解决上述两个难题,SIS材料将成为理想的骨组织工程材料。由于SIS本身取自于软组织,作为骨组织工程骨架材料存在机械强度不足的缺陷,为了使SIS骨架材料在植入体内初期更好地提供支撑,需要增加它的机械强度。
[0003]天然骨的无机成分主要由羟基磷灰石组成,直接将SIS与羟基磷灰石混合作为人造骨,虽然可以提高机械强度,使得基质材料的组成接近于天然骨,但是这种混合只是实现了宏观组分上模仿天然骨的组成,而在微观结构上,磷酸钙分子与其他细胞外基质组分在空间上的分布和结合和天然骨还是有很大差异。
[0004]骨组织工程中所需要的成骨诱导因子一直是一个研宄热点,BMP-2蛋白虽然是广泛被认可和采用的最有效成骨诱导因子,但是由于其非常昂贵,而采用BMP基因导入方法又存在一定的安全问题,因此它的临床使用还是受到成本和安全性的制约;同时BMP-2和其他蛋白药物都存在稳定性差,在体内半衰期很短的问题,相应对于药物释放体系的要求非常高。因此寻找低成本、稳定又可以高效诱导骨再生的小分子化合物来替代BMP是非常有意义的。

【发明内容】

[0005]本发明所要解决的技术问题是:针对现有技术的不足,提供一种细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨及其制备方法。
[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨,该仿生复合工程骨的微观结构包括SIS胶原纤维骨架、矿物化结晶和细胞外基质成分,所述的SIS胶原纤维骨架呈网状纤维结构,所述的矿物化结晶和所述的细胞外基质成分沉积于所述的SIS胶原纤维骨架上,所述的矿物化结晶和所述的细胞外基质成分由MC3T3-E1 Subclone 14细胞指导和分泌得到,所述的矿物化结晶主要由轻基磷灰石结晶构成。
[0007]本发明细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨具有较高的机械强度,该组织工程骨与天然骨内部的矿物化结构和分布极为接近,具有高度类似于天然骨的微观结构。
[0008]所述的矿物化结晶的沉积量为68.50±6.75 mg/cm3,可确保仿生复合工程骨的机械强度满足使用要求。
[0009]上述细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨的制备方法,包括以下步骤:
O细胞培养及传代:准备含有5-10%胎牛血清的a -MEM培养基作为培养液;将从小鼠颅顶前骨MC3T3-E1细胞系中分离的MC3T3-E1 Subclone 14细胞置于5% 二氧化碳浓度、370C的细胞培养箱中培养,所述的培养液的用量为200 μ L/cm2,每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液,确保培养液的用量为200 μ L/cm2,当培养至MC3T3-E1 Subclone 14细胞汇合度大于90%时进行细胞传代,所述的细胞传代的过程为:弃去旧的培养液,加入用量为200 μ L/cm2的PBS缓冲液,清洗2_3次;然后加入用量为40-50 μ L/cm 2的0.25%的胰酶,在37°C下孵育I min ;收集细胞并加入至离心管,在1000 rpm转速下离心2 min ;弃去上清,然后加入I mL培养液重悬细胞,得到细胞悬液,对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度;根据计算得到的细胞密度,将所述的细胞悬液以(1-2) X 14细胞/cm2的用量加入至新的细胞培养瓶,然后在该细胞培养瓶中加入5 mL的培养液混匀,置于细胞培养箱中培养;重复上述细胞传代过程直至获得足够量的MC3T3-E1 Subclone 14细胞;
2)SIS仿生工程骨的制备:取出干燥无菌的SIS材料,用剪刀或合适器械裁剪成所需的大小及形状,再将裁剪好的SIS材料浸泡于所述的培养液,置于37°C的细胞培养箱中预处理24-48h ;取汇合度为70-80%的MC3T3-E1 Subclone 14细胞,加入至离心管,在1000 rpm转速下离心2 min,弃去上清,再加入I mL培养液重悬细胞,得到细胞悬液,对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度,然后根据计算得到的细胞密度将该细胞悬液稀释至I X 16细胞/mL的终浓度,即配制得到细胞悬液;取出浸泡24-48h的SIS材料,平铺于新的细胞培养皿上,再按5 X 13细胞/mm2的细胞密度将配制得到的稀释的细胞悬液均匀滴加于SIS材料上,完成对SIS材料的细胞种植,然后立即放入细胞培养箱中孵育;孵育4-6h后,取出植有细胞的SIS材料,用l-2mL/cm2用量的培养液清洗2_3次,除去表面未黏附的细胞,之后以2.5 mL/cm2的用量加入新的培养液,最后将该植有细胞的SIS材料置于细胞培养箱孵育;
3)复合工程骨的制备:植有细胞的SIS材料于细胞培养箱孵育16h后,得到细胞-SIS复合材料,从细胞培养箱中取出该细胞-SIS复合材料,弃去旧的培养液,加入等量诱导矿物化及成骨分化的组合培养液,所述的组合培养液为含有8-15mM的CaCl2、(1-10) X 10_6 M的淫羊藿苷和5-10%胎牛血清的a -MEM培养基,然后置于37°C的细胞培养箱孵育,此后每隔48h更换一次组合培养液,处理4-8周时间后,得到SIS复合工程骨;
4)复合工程骨的去细胞化:取出上述处理得到的SIS复合工程骨,以用量为(1-2)mL/cm2的PBS缓冲液清洗2-3次;此后将该SIS复合工程骨置于_80°C /37°C反复冻融3_5次,每次I h ;之后再次以用量为(l_2)mL/cm2的PBS缓冲液清洗2_3次,进行去细胞化;将去细胞化后的复合工程骨置于_80°C保存备用,此即为细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨。
[0010]本发明方法选用的MC3T3-E1细胞系细胞易保存使用,同时具有体外无限增殖能力,为工程骨制备方法的稳定和产品生产提供了有利条件。
[0011]淫羊藿苷是植物药淫羊藿的主要活性成分,淫羊藿苷安全、经济、化学性质稳定,具有促骨再生能力和促血管再生能力,本发明通过淫羊藿苷刺激Sis上的成骨细胞,赋予本发明复合工程骨优异的成骨诱导性。
[0012]本发明方法选用SIS材料作为骨架材料,SIS是以胶原为骨架的细胞外基质材料,含有90
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