用于耐药性乳腺癌预后和治疗的作为新治疗助剂和生物标志物的miRNA的制作方法
【专利说明】用于耐药性乳腺癌预后和治疗的作为新治疗助剂和生物标 志物的miRNA
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年11月16日提交的美国临时专利申请No. 61/727,481的优 先权权益，其通过引用以其整体并入本文。
[0003] 说明书 [0004] 发明背景
[0005] A.发明领域
[0006] 本发明涉及微RNA(miRNA)用于治疗癌症的用途，以及这些组合物用于治疗癌症 的用途。
[0007] B.相关领域描述
[0008] 所有乳腺癌中大约15 %至20 %是三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC)。这些癌症通常表现出不同的、侵袭性转移方式。接受TNBC诊断的那些的预 后通常是不良的，并且随之不成比例数目的乳腺癌死亡。虽然在TNBC疾病的早期阶段化学 治疗响应率（response rate)更好，但是超过60%的TNBC患者发生化学抗性，这导致早期 复发和缩短的存活。
[0009] miRNA是小的、非蛋白质编码RNA，其在基因调控中起着广泛作用。超过60%的人 蛋白质编码基因的信使RNA可被miRNA靶向，其在许多人细胞类型中大量存在（Friedman 等，2009)。人类基因组编码超过1000个miRNA(在曼彻斯特大学miRBase中列出了超过 1000 个智人（Homo sapiens)miRNA)〇
【发明内容】
[0010] 在一种情况下，公开了用于减少癌细胞生长的方法，所述方法包括向对象施用有 效量的包含hsa-miR-204或其同源物的组合物，所述对象具有或疑似具有hsa-miR-204或 其同源物表达降低或显著降低的癌细胞。在某些方面中，在所述对象的癌细胞中脑源性神 经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF)或埃兹蛋白是过表达或显著地 过表达的，所述对象具有或疑似具有hsa-miR-204或其同源物表达降低或显著降低的癌细 胞。
[0011] 在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在某些方面中，所述对象是人。所述对 象可患有癌症，例如乳腺癌、卵巢癌或儿科肾肿瘤。在某些方面中，所述患者的乳腺癌细胞 是三阴性乳腺癌（TNBC)细胞。在某些方面中，癌细胞生长是转移性的。
[0012] 在一些实施方案中，所公开的用于减少癌细胞生长的方法还包括测定对象的细胞 中hsa-miR-204或其同源物的水平。在一些相关的实施方案中，所公开的方法是用于鉴 定可能从用于减少癌细胞生长的治疗受益的患者，所述方法包括测定所述对象的细胞中 hsa-miR-204或其同源物的水平。
[0013] 在某些方面中，通过使用基于定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR)的方法 或基于阵列杂交的方法来测定hsa-miR-204或其同源物的水平。在一些方面中，测定 hsa-miR-204或其同源物的水平是测定从对象获得的血液样品中hsa-miR-204或其同源物 的水平。在一些方面中，测定出从对象获得的血液样品中hsa-miR-204或其同源物的水平 处于降低的水平。
[0014] 在一些实施方案中，包含hsa-miR-204或其同源物的组合物配制成用于全身施 用。在某些方面中，通过静脉内注射来施用该组合物。在某些另外的方面中，所述包含 hsa-miR-204或其同源物的组合物还包含基于脂质的递送载剂（vehicle)或基于纳米颗粒 的递送载剂。
[0015] 在另一些实施方案中，还向对象施用包含第二活性剂的组合物。在另一些方面中， 所述第二活性剂是细胞毒性化学治疗剂、纳米生物缀合物（nanobioconjugate)或者除了 hsa-miR-204或其同源物之外的miRNA。在某些另外的方面中，所述细胞毒性化学治疗剂包 括紫杉烷，并且在某些另外的方面中，所述紫杉烷是紫杉醇（paclitaxel)。
[0016] 在包括施用包含第二活性剂的组合物的一些实施方案中，同时施用包含 hsa-miR-204或其同源物的组合物与包含第二活性剂的组合物。在一些另外的实施方案 中，在施用包含第二活性剂的组合物之前或之后施用包含hsa-miR-204或其同源物的组合 物。在某些方面中，包含hsa-miR-204或其同源物的组合物与包含第二活性剂的组合物之 间的施用时间间隔可以为1天至30天，或者其可以为0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、 0·9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30或更多小时或天，或者其中可推导出的任意整数。
[0017] 在还包括施用包含第二活性剂的组合物的某些实施方案中，在施用包含 hsa-miR-204或其同源物的组合物之前施用包含第二活性剂的组合物。在某些另外的方面 中，其包括在包含hsa-miR-204或其同源物的组合物之前施用包含第二活性剂的组合物， 癌细胞已经变得对所述第二活性剂有抗性。在某些另外的方面中，在包含hsa-miR-204或 其同源物的组合物之前施用包含第二活性剂的组合物，并且所述第二活性剂是化学治疗药 物。在某些另外的方面中，所述第二活性剂是紫杉酚（taxol)。在某些另外的方面中，所述 第二活性剂是紫杉醇。
[0018] 在上述方法的一些实施方案中，包含hsa-miR-204或其同源物的组合物取自包含 可药用载体的制剂。在一些方面中，所述制剂还满足对于无菌、热原和颗粒物质或其他污染 物的药典要求，或者将其配制成用于全身施用，或者既满足上述药典要求也将其配制成用 于全身施用。
[0019] 还公开了用于筛选潜在致敏物miRNA的方法，当其被抑制时，增加在亚致死浓度 的治疗活性剂中培养的癌细胞系细胞的生存力，所述方法包括：在含有miRNA抑制剂的培 养基中培养癌细胞系细胞一段时间，所述含有miRNA抑制剂的培养基包含亚致死浓度的治 疗活性剂以及候选致敏物miRNA的抑制剂；在缺乏miRNA抑制剂的培养基中培养癌细胞系 细胞相同的一段时间，所述缺乏miRNA抑制剂的培养基包含亚致死浓度的治疗活性剂但是 没有添加所述候选致敏物miRNA的抑制剂；并且在一段时间之后，测定含miRNA抑制剂细 胞群和缺乏miRNA抑制剂细胞群的生存力，其中如果所述含miRNA抑制剂细胞群（用治疗 活性剂和候选致敏物miRNA抑制剂培养）的生存力显著高于所述缺乏miRNA抑制剂细胞群 (用治疗活性剂但是没有添加候选致敏物miRNA抑制剂培养）的生存力，则将所述候选致敏 物miRNA鉴定为潜在致敏物miRNA。
[0020] 在用于筛选的该方法的某些方面中，所述潜在致敏物miRNA是hsa-miR-204、 hsa-miR-185、hsa-miR-211、hsa-miR-367_5p(还称为 hsa-miR-367 * )或 hsa_miR-133A， 或者这些miRNA之任意一种的同源物。在某些方面中，所述治疗活性剂的亚致死浓度是以 其培养72小时之后，80%的所述癌细胞系细胞保持活力的浓度。在某些另外的方面中，所 述治疗活性剂是例如在2nM至SnM亚致死浓度下的紫杉酚和/或其他化学治疗药物。在某 些另外的方面中，所述癌细胞系细胞是TNBC细胞。
[0021] 还公开了用于筛选潜在脱敏物miRNA的方法，当其被抑制时，降低在亚致死浓度 的治疗活性剂中培养的癌细胞系细胞的生存力，所述方法包括：在含有miRNA抑制剂的培 养基中培养癌细胞系细胞一段时间，所述含有miRNA抑制剂的培养基包含亚致死浓度的治 疗活性剂以及候选脱敏物miRNA的抑制剂；在缺乏miRNA抑制剂的培养基中培养癌细胞系 细胞相同的一段时间，所述缺乏miRNA抑制剂的培养基包含亚致死浓度的治疗活性剂但是 没有添加所述候选脱敏物miRNA的抑制剂；并且在一段时间之后，测定含miRNA抑制剂细 胞群和缺乏miRNA抑制剂细胞群的生存力，其中如果所述含miRNA抑制剂细胞群（用治疗 活性剂和候选脱敏物miRNA抑制剂培养）的生存力显著低于所述缺乏miRNA抑制剂细胞群 (用治疗活性剂但是没有添加候选脱敏物miRNA抑制剂培养）的生存力，则将候选脱敏物 miRNA鉴定为潜在脱敏物miRNA。
[0022] 在用于筛选的该方法的某些方面中，所述潜在脱敏物miRNA是hsa-miR-129-3p、 hsa-miR-296-5p、hsa-miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 *、hsa_miR-320d，或者这些 miRNA之任意一种的同源物。在某些方面中，所述治疗活性剂的亚致死浓度是以其培养72 小时之后，80%的所述癌细胞系细胞保持活力的浓度。在某些另外的方面中，所述治疗活性 剂是例如在2nM至SnM的亚致死浓度下的紫杉酚和/或其他化学治疗药物。在某些另外的 方面中，所述癌细胞系细胞是TNBC细胞。
[0023] 在一些实施方案中，公开了用于减少癌细胞生长的方法，其包括向对象施用有效 量的包含致敏物miRNA或致敏物miRNA之同源物的组合物，所述对象具有或疑似具有致敏 物miRNA表达降低或显著降低的癌细胞。在一些实施方案中，公开了用于减少癌细胞生长 的方法，所述方法包括向对象施用有效量的包含脱敏物miRNA抑制剂或脱敏物miRNA之同 源物抑制剂的组合物，所述对象具有或疑似具有脱敏物miRNA表达显著增加的癌细胞。
[0024] 在一些实施方案中，公开了用于鉴定可能从用于减少癌细胞生长的治疗受益的对 象的方法，所述方法包括测定所述对象的细胞中致敏物miRNA或致敏物miRNA同源物的水 平。在某些方面中，该方法的致敏物miRNA是hsa-miR-204、hsa-miR-185、hsa-miR-211、 hsa-miR-367_5p (还称为 hsa-miR-367 * )、hsa_miR-133A 或这些致敏物 miRNA 之一的同 源物。
[0025] 在一些实施方案中，公开了用于鉴定可能从用于减少癌细胞生长的治疗受益的 对象的方法，所述方法包括测定所述对象的细胞中脱敏物miRNA或脱敏物RNA同源物 的水平。在某些方面中，该方法的脱敏物miRNA是hsa-miR-129-3p、hsa-miR-296-5p、 hsa_miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 *、hsa_miR-320d 或这些脱敏物 miRNA 之一 的同源物。
[0026] 在表 1 中提供了 致敏物 miRNA hsa-miR-204、hsa-miR-185、hsa-miR-211、 hsa-miR-367-5p(还称为 hsa-miR-367 * )和 hsa-miR-133A( SP， hsa-miR-133A-2)， 以及脱敏物 miRNA hsa-miR-129-3p ( SP，hsa-miR-129-l 的-3p 区）、hsa-miR-296-5p、 hsa_miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 * 和 has_miR-320d 之莖环序列的序列和 SEQ ID NO。
[0027] 当提及miRNA使用时，术语"同源物"是指像所提及的miRNA那样起作用（例如，像 所提及的miRNA那样能够靶向基因表达）的寡核苷酸。同源物通常具有与所提及的miRNA 在性质（例如，序列和结构）上的相似性水平，根据本公开内容，本领域普通技术人员可将 其鉴定为所提及序列的同源物（例如，使用miRNA同源物鉴定工具，例如，在默认/严格参 数下的 miRNAminer ;参见，例如，可在 groups, csail. mit. edu/pag/mirnaminer/ 上在线获 得的miRNAminer工具；还参见Artzi等，2008) 〇
[0028] 除非另外指明（例如，提及序列同源性或比对），对于化合物，本文表达的百分比 值是按重量计的重量并且与总组合物有关。
[0029] 术语"显著地"（例如，当提及例如"减少"或"增加"；"较低"或"较高"；"抑制" 或"过表达"；"未能超过"或"超过"或者类似类型的限定语而使用时）是指参照或测试样 品中的水平，其至少为大于测定标准误差之幅度的幅度，所述测定用于评估限定语所应用 的特征。在一些情况下，参照或测试样品的统计学显著性可与小于0. 25、0. 15、0. 10、0. 05、 0· 025、0· 01