使用蛋白质前体作为前药的方法
【专利说明】
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是于2011年6月30日递交的美国专利申请13/174,520的部分继续申请， 其享有于2010年7月2日递交的美国临时申请61/361，248的权益，因此将这些申请的所 有内容都通过援引并入本文中。
[0003] 关于受联邦资助的研发的声明
[0004] 本发明依NIH和HIGMS授予的合同GM 063647在政府支持下完成。政府享有本发 明的一定权利。
技术领域
[0005] 本发明属于药物递送和蛋白质工程领域。更具体而言，本发明涉及用于递送基于 蛋白的治疗剂（例如激素原或因子原（profactor))的方法和组合物，其无需体外化学加工 或蛋白水解加工就能产生治疗有效的药物。
【背景技术】
[0006] 许多具有生物活性的肽或蛋白，包括激素、细胞因子、神经肽和生长因子，最初是 以更大的无活性前体肽的形式产生。这些前体肽或前肽（包括激素原或因子原）通常需要 特定的细胞内蛋白水解加工来使其转变成其活性形式以发挥生物学功能[1，2]。对于蛋白 制造而言，经常先合成肽的前体形式而不是成熟形式。这是因为肽的成熟形式往往具有复 杂的构象、收率低或结构不稳定。对于蛋白药物递送而言，将前肽（而非成熟的肽）通过化 学缀合或重组融合与另一蛋白部分连接，从而实现特定的递送目标并增强蛋白的整体稳定 性[3]。因此，为了展现出生物学活性，需要对前肽进行加工并激活，这是制造重组治疗肽时 的重要而具有挑战性的一步。
[0007] 递送前药的常规方法通常涉及将前肽与递送蛋白连接在一起的化学缀合。但是， 将两个结构域化学缀合在一起的主要障碍在于，最终产物的组成和尺寸可以是异源的，这 对于治疗用途而言是不能接受的。因此，仍需要一种更好的方法来形成将递送结构域与前 药结构域连接在一起的融合蛋白。
【发明内容】
[0008] 本发明基于以下出人意料的发现：在转铁蛋白受体介导的胞吞作用中，肝细胞和 上皮细胞的细胞内区室具有将胰岛素原转化为胰岛素的能力。受此发现的启发，本发明人 设想并实践了一种通过将蛋白因子的前肽与转铁蛋白结构域缀合来配制基于蛋白的药物 的方法。例如，可以通过将胰岛素的前肽（即胰岛素原）与转铁蛋白缀合来形成基于胰岛 素的蛋白药物。在与肝细胞温育时，该胰岛素原-转铁蛋白缀合物或融合蛋白将转化为完 全活性的胰岛素-转铁蛋白。除了充当活化元件外，转铁蛋白部分还能够提高胰岛素或其 他治疗性肽的稳定性和持久活性（与其未缀合的对应物相比）。
[0009] 本领域技术人员知晓，许多蛋白因子的前肽，例如胰岛素原和高血糖素原，不能用 作药物，除非已通过化学处理或蛋白水解处理切断了特定肽键而将它们转化成活性肽，例 如，从胰岛素原上移除C-肽。或者，可以用两肽重组法合成胰岛素，该方法包括进行CNBr处 理来分别产生A链和B链，而后进行氧化还原反应来形成链间二硫键[4]。此类在前肽产生 后进行的修饰加工对于产生治疗性肽而言不但在技术上有挑战性，而且成本效益很低。本 发明使得能够在不进行额外的化学加工或酶促加工的情况下使用前肽作为药物。
[0010] 减少肝葡萄糖生成已是糖尿病治疗策略的靶点。胰岛素（INS)的生物活性能够 影响肝葡萄糖生成和外周葡萄糖移除（glucose disposal)。通常，胰脏将INS直接递送 至肝门静脉，因此肝暴露在高浓度的INS下，由此对肝葡萄糖生成（HGP)造成更大的影 响。在常规的INS疗法中，皮下施用INS和/或INS类似物，从而使肝脏得到胰岛素治疗 (under-insulinized liver)。之后对外周葡萄糖移除的效果变大，导致代谢异常，包括过 大的血糖波动、血脂异常、血浆IGF-I减少以及生长激素血浆水平升高[9]。因此，对HGP的 效果大于对外周葡萄糖移除的效果的INS疗法将比现有的治疗方案具有优势。本发明的出 乎意料的发现是，本发明的融合蛋白能够在体内向肝脏靶向递送，具体而言，本文所述的胰 岛素原_转铁蛋白融合蛋白能够在体内向肝脏靶向递送。
[0011] 因此，在一方面，本发明提供一种用作前药的融合蛋白。本发明的该方面的实施方 式的融合蛋白通常具有通过连接序列与第二蛋白前体结构域连接的第一递送结构域。该递 送结构域是能够促进通过胞吞途径而进入靶细胞的蛋白。第二蛋白前体结构域优选是激素 原或因子原。
[0012] 在另一方面，本发明还提供一种将蛋白前体结构域递送至需要该前体结构域的受 试对象中的方法。本发明的该方面的实施方式的方法通常包括如下步骤：形成具有与蛋白 前体结构域连接的递送结构域的融合蛋白，和将该融合蛋白施用给患者。
[0013] 在又一方面，本发明还提供一种形成用作前药的融合蛋白的方法。本发明的该方 面的实施方式的方法通常包括：为蛋白前体选择用作递送结构域的蛋白；构建载体，所述 载体编码通过适合的连接序列与所述蛋白前体连接的所述递送结构域；和在适合的表达宿 主中表达所述融合蛋白。
[0014] 在又一方面，本发明还提供一种延长蛋白前体结构域的血浆半衰期的方法。本发 明的该方面的实施方式的方法通常包括如下步骤：将该蛋白前体结构域导入血浆中之前， 将蛋白前体结构域缀合至转铁蛋白结构域。此处，转铁蛋白结构域充当半衰期延长元件，用 来延长蛋白前体在血浆中的血浆半衰期。
[0015] 在又一方面，本发明还提供一种延长蛋白前体在受试对象中的治疗效果的方法。 本发明的该方面的实施方式的方法通常包括如下步骤：将蛋白前体缀合至转铁蛋白结构 域，以形成通过连接序列与转铁蛋白结构域连接的蛋白前体结构域。此处，转铁蛋白结构域 充当治疗有效性稳定化元件，其延长蛋白前体的治疗有效期。
[0016] 在又一方面，本发明还提供一种将蛋白前体前药靶向至受试对象的肝脏的方法。 本发明的该方面的方法通常包括如下步骤：向受试对象施用前药，其中，所述前药是融合蛋 白，所述融合蛋白包含通过连接序列与第二蛋白前体结构域连接的第一递送结构域。该肝 脏递送结构域是能够在体内靶向递送至肝脏的蛋白，更优选的是，其还促进通过胞吞途径 进入肝细胞。优选的是，肝脏递送结构域是转铁蛋白。第二蛋白前体结构域优选是激素原 或因子原。在一个优选实施方式中，所述融合蛋白是胰岛素原-转铁蛋白融合蛋白。
[0017] 本发明的其他方面和优点将从以下说明和所附权利要求中变得明显。
【附图说明】
[0018] 图1图示了在pcDNA 3. 1(+)载体中的前胰岛素原-Tf?融合蛋白基因构建体。
[0019] 图2示出了使用抗Tf抗体和抗胰岛素（原）抗体对胰岛素原（PI)-转铁蛋白 (Tf)融合蛋白进行蛋白质印迹的结果，该结果证明了融合蛋白中的Tf和胰岛素原均表达。 第1至第5道是抗Tf印迹，第7道是抗胰岛素（原）印迹。第1道：5ng脱铁Tf (apo-Tf)。 第2道：20ng脱铁Tf。第3道：PI-Tf。第4道：5ng脱铁Tf+PI-Tf。第5道：20ng脱铁 Tf+PI-Tf。第 6 道：标记。第 7 道：PI-Tf。
[0020] 图3示出了肝癌H4IIE细胞的葡萄糖生成的图。其证明了 PI-Tf融合蛋白的抑制 肝葡萄糖生成的活性高于胰岛素和胰岛素原。此外，图3B示出了在存在极大过量的Tf时 可以破坏PI-Tf的活性，表明该活性受到TfR结合的介导。（A)胰岛素原、胰岛素和PI-Tf 融合蛋白的抑制曲线。（B)增加的肝葡萄糖生成被1000倍Tf共温育所阻断。
[0021] 图4示出了溶液中的胰岛素的测量结果的图。其证明了在肝癌H4IIE细胞的存在 下PI-Tf转化成胰岛素-Tf。
[0022] 图5示出了阐明了对胰岛素受体结合的竞争的柱状图。其证明了在37°C下在 H4IIE细胞中预先温育的PI-Tf融合蛋白的胰岛素受体结合亲和力提高。
[0023] 图6示出了脂肪细胞的葡萄糖摄取的柱状图，其证明了培养的脂肪细胞对2-脱 氧-D-[2, 6-