N-(苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一类小分子化合物的医药应用，具体涉及N-(苯 基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物或其可药用盐在制备用于治疗与MIF相关的炎症性 疾病的药物，特别是MIF抑制剂中的用途。
【背景技术】
[0002] 巨细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一 种集细胞因子、酶活性、神经内分泌激素于一身的多功能蛋白质。作为一种细胞因子，MIF 几乎参与所有炎症性疾病过程，它通过活化巨噬细胞和T细胞来促进先天性和获得性免疫 响应，是先天性免疫系统的重要调节因子，被认为是连接内分泌系统和免疫体系的介导剂。 MIF与多种免疫性和炎症性疾病的发病机制密切相关，如MIF在单核/巨噬细胞的血管壁粘 附、跨膜移动、内皮下聚集、泡沫细胞形成及斑块稳定中的作用，涉及到类风湿性关节炎、动 脉粥样硬化发生和发展的多个方面。MIF还直接影响正常细胞的分裂和瘤基因诱导的恶性 转化，或间接通过调节机体免疫反应，促进细胞增殖、迀移以及血管增生等。
[0003] 由于具有广泛的生物活性，MIF与多种免疫、炎症以及肿瘤等疾病密切相关，已经 成为治疗这些疾病的一个重要靶点。在与MIF相关的抗炎药物研宄方面，国外许多医药公 司和科研机构正在开发新的具有抗炎效果的MIF抑制剂，但目前还没有成功上市的MIF抑 制剂。因此，积极寻找和设计新的MIF抑制剂，并探索其抗炎效果，具有重要的临床意义和 广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004] 针对上述情况，本发明提供了N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物或其 可药用盐在制备用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物中的用途，其中所述N-(苯基氨 基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物具有如式I所示的结构：
其中： R1为氢或卤素； R2为氢、卤素、甲基或甲氧甲酰基； R3为氢、卤素、甲基、异丙基、甲氧甲酰基、苯氧基甲基、三氟甲基、苯基、3, 5-二氟苯基、 3, 5-二氯苯基或3, 5-二三氟甲基苯基； R4为氢、卤素、甲基、甲氧基或甲氧甲酰基； R5为氢、卤素、乙酰基、羧基或羟甲基； R6为氢、羟基、羧基、乙酰基、乙酰氨基、甲氧甲酰基、乙氧甲酰基、氨基甲酰基或苯甲酰 氨基； R7为氢或羧基。
[0005] 优选的，在上述技术方案中，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物选 自化合物中的任意一种。
[0007] 优选的，在上述技术方案中，所述可药用盐包括(但不限于)N-(苯基氨基硫代甲酰 基）苯甲酰胺类化合物(特别是化合物I^I4C1)与盐酸、磷酸、硫酸等无机酸形成的酸加成盐 以及与醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸、酒石酸等有机酸形成的酸加成 盐。
[0008] 优选的，在上述技术方案中，所述与MIF相关的炎症性疾病包括(但不限于)类风湿 性关节炎、动脉粥样硬化和败血症。
[0009] 优选的，在上述技术方案中，所述用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物为MIF 抑制剂。
[0010] 本发明对上述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物进行了生物学活性 测定，发现其对MIF具有明显的酶抑制活性，对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264. 7中的糖皮质激 素具有负向调节效果，可以显著抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎性因子 (TNF-a和NO)的释放，这些化合物还可以抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移。此外， MTT法检测证实这些化合物在10、20和40yM三个浓度下对小胶质细胞BV-2和巨噬细胞 RAW264. 7的活力均没有显著影响。在此基础上，进一步研宄化合物抗炎作用是否与抑制 MIF对ERK1/2的活化有关，发现这些化合物可以抑制ERK1/2的磷酸化。
[0011] 本发明中的N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物具备MIF抑制剂的功 能，对与MIF相关的炎症性疾病具有明显的抑制作用，可以用于制备与MIF相关的抗炎药 物。
【附图说明】
[0012] 图1为实施例1中化合物15、18、113和Ii^MIF的酶抑制活性曲线，其中上述化 合物15、18、1 13和I15依次对应图中的（a)、（b)、（c)和（d)。
[0013] 图2为实施例2中化合物15对MIF引起的巨噬细胞趋化迀移的影响效果图。
[0014] 图3为实施例3中化合物15对培养细胞的敏感性效果图。
[0015] 图4为实施例4中化合物15、18、113和I15对小胶质细胞中LPS诱导炎性因子的影 响效果图。
[0016] 图5为实施例5中化合物15对MIF刺激的RAW264. 7巨噬细胞中ERK活化的影响 效果图。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进一步的描述。
[0018] 实施例1 :化合物对MIF的酶抑制活性实验。
[0019] 实验原理：MIF具有多巴色素互变异构酶活性，可以将橙色的D，L型多巴色素甲 醋转化为无色的11引噪衍生物，吸光度采用TecanInfiniteM1000酶标仪在475nm波长下 进行3分钟吸光度测试。
[0020] 实验试剂的准备：脂多糖(大肠杆菌血清型〇55:B5)、（L)-3, 4-二羟基苯丙酮酸甲 酯和高碘酸钠购买自西格玛奥德里奇(美国密苏里州东部城市圣路易斯）；（S，R) -3- (4-羟 苯基）-4, 5-二氢-5-异恶唑乙酸甲酯（IS0-1)为MIF的典型抑制剂，购买自德国Merck公 司旗下的生化试剂品牌Calbiochem公司，在这里作为阳性对照；将化合物溶解在IOmM的 DMSO储备溶液中，最后在缓冲液中DMSO的浓度低于0. 25%情况下，将RAW264. 7巨噬细胞 在37°C条件下添加5%热灭活胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS)，庆大霉素（50g/ml)和 5%(1)2的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium，DMEM)中生 长和维持，重组人类MIF在大肠杆菌中表达，并且进行纯化。
[0021] 实验步骤：为了制备（L)-多巴色素甲醋，将等体积L-3, 4-二羟基苯甲基丙氨酸甲 酯（4mM)和高碘酸钠（IOmM)混合，并且在室温下培养3~5分钟，然后将（L)-多巴色素甲酯 (30yL)添加到包含重组人类MIF(120nM)和IOmM磷酸钾缓冲液的96孔板中，另外添加 0. 5mMEDTA并保持pH=6. 2。为了测试化合物对MIF互变异构酶活性的抑制效应，将浓度为 1、 5、10、25、50和100yM的化合物分别添加到包含重组人类MIF( 120nM)的96孔板中，在添 加（L)-多巴色素甲酯之前培养30分钟，将孔板中的气泡去掉，采用TecanInfiniteMlOOO 酶标仪在475nm波长下进行3分钟吸光度测试。
[0022] 实验结果：将浓度为1、5、10、25、50和100 11|1的^(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲 酰胺类化合物进行MIF的酶抑制活性实验，发现大多数化合物具有较好的抑制活性，其半 抑制浓度TIC5tl见表1，其中化合物15、18、1 13和I15的11(：5(|曲线图参见图1。
[0023] 表1.化合物对MIF互变异构酶的抑制活性（TIC5tl)以及TIC5Q〈10yM的化合物对 LPS诱导的RAW264. 7巨噬细胞分泌NO的影响（NIC5tl)
[0024] 对LPS诱导的RAW264. 7巨噬细胞分泌NO的影响（NIC5tl) [0023]实施例2 :化合 物对MIF引起的巨噬细胞趋化迀移的影响。
[0025] 实验原理：MIF对巨噬细胞有趋化迀移作用，抑制剂作用于MIF，可以在一定程度 上抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移。
[0026] 实验步骤：将重组人类MIF在添加或者缺失MIF互变异构酶抑制剂的情况下，分别 置于CM-16板的下室，然后在上室将RAW264. 7巨噬细胞接种于包含20000个细胞的无血 清培养基中。