雌激素及其受体激动剂在制备抗肝细胞肝癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及雌激素及其受体激动剂的新用途，尤其涉及雌激素及其受体激动剂在制备抗肝细胞肝癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞肝癌是常见的恶性肿瘤，居我国恶性肿瘤发生率的第四位。肝细胞肝癌恶性程度高，病情发展快，预后差，平均生存期6-8月，其死亡率占我国恶性肿瘤的第二位，仅次于肺癌。由于肝细胞肝癌对临床上使用的化疗药物均不敏感，目前临床上治疗肝细胞肝癌有效的方法仍然是外科手术治疗。但由于肝细胞肝癌病情发展快，大多数患者就诊时由于较差的肝功能情况、基础的肝脏疾病或远处转移的出现，已经不适宜进行外科手术治疗。即使少数能进行外科手术治疗的病人，手术后仍然具有较高的复发率。而且，目前对肝细胞肝癌手术后的复发仍无有效的治疗方法。近年来，随着肿瘤细胞分子生物学研究的进展，人们在研究争对肝细胞肝癌的分子靶向治疗。目前，索拉非尼(Sorafenib:是血管内皮生长因子、血小板源生长因子、表皮生长因子和胰岛素生长因子等多种激酶的抑制剂)已经被美国FDA批准作为肝细胞肝癌的治疗。但广泛的临床试验研究发现，与安慰剂相比，索拉非尼延长病人的生存期仅仅3月。而且，索拉非尼价格昂贵。因此，对于具有可怕预后的肝细胞肝癌，寻找其有效的治疗药物仍然是迫切需要的。
[0003]雌激素是一种女性激素，由卵巢和胎盘产生。肾上腺皮质也产生少数雌激素。女性儿童进入青春期后，卵巢开始分泌雌激素，以促进阴道、子宫、输卵管和卵巢本身的发育，同时子宫内膜增生而产生月经。雌激素还能促使皮下脂肪堆积，使体态丰满；乳腺增生，乳头乳晕着色，并产生性爱和性欲；促使体内钠和水的潴留，骨中钙的沉积等。雌激素主要来源于卵泡内膜细胞和卵泡颗粒细胞。在卵泡发育过程中，先经LH刺激卵泡内膜分泌睾酮，再经颗粒细胞在FSH刺激下转化为雌二醇，即“双细胞双促性素作用模式”。此外肾上腺皮质、胎盘和雄性动物睾丸也有分泌。这里雌激素的定义是雌二醇，卵巢功能衰竭后，雌二醇急剧下降引起更年期综合征等雌二醇缺乏疾病。
[0004]已知的雌激素的用途主要是可以刺激卵泡发育，间接影响卵巢功能。它能加速卵子在输卵管的运行速度，还可对子宫内膜和平滑肌的代谢有明显促进作用。另外，适量的雌激素为胚泡着床所必需。雌激素还可促进阴道上皮基底层细胞增生、分化、成熟以及角化和引起核致密变化。雌激素不仅可以刺激人类乳腺导管的生长，也能促进乳腺腺泡的发育及乳汁生成。雌激素一方面可以刺激肾上腺皮质激素分泌和对抗生长激素的作用，表现为促进蛋白分解；另一方面，对肝脏则有蛋白同化作用，可以刺激多种血浆蛋白的合成。有促进骨质致密的作用，但能使骨骺提早闭合和骨化而影响骨的长度增加。绝经期妇女可用雌激素治疗骨质疏松症。在心血管方面，雌激素可以降低血管通透性，降低血清胆固醇。
[0005]但迄今为止，未发现雌激素在抗肝细胞肝癌药物中的应用。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供雌激素及其受体激动剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用，它发现雌激素能有效的抑制肝细胞肝癌细胞的增殖和生长，促进肝细胞肝癌细胞的凋亡，可以成为治疗肝细胞肝癌的新的药物。
[0007]本发明是这样实现的:
1.本发明通过细胞实验的结果显示雌激素抑制了人肝细胞肝癌细胞的增殖和生长；
2.通过动物模型实验的结果显示雌激素抑制了人肝细胞肝癌细胞在肝脏内的生长，抑制了人肝细胞肝癌组织内Ki67和PCNA的表达，抑制了化学物质诱导的小鼠肝细胞肝癌的发生。
[0008]3.通过进一步的细胞实验的结果显示雌激素明显的诱导了人肝细胞肝癌细胞的凋亡。
[0009]雌激素主要通过雌激素受体发挥作用，雌激素受体激动剂与雌激素可以获得相同的作用。
[0010]本发明发现雌激素能有效地抑制肝细胞肝癌细胞的增殖和生长，抑制肝细胞肝癌的发生，诱导肝细胞肝癌细胞的凋亡。雌激素及其受体激动剂是可以应用于制备能有效治疗肝细胞肝癌的药物，而雌激素及其受体激动剂在制备抗肝细胞肝癌药物中的用途属于首次公开，而且其在对于抑制人肝细胞肝癌细胞的增殖和生长方面有意想不到的作用，因此具备了突出的实质性特点和显著的进步。
【附图说明】
[0011]图1展示了雌激素对人肝细胞肝癌细胞SMMC7721、H印G2、BEL7404、Huh7、MHCC-97L、MHHCC-97H、PLC/PRF/5、SK-HEP-l、HCCLM3 和 BEL7402 细胞增殖的影响。
[0012]图2展示了雌激素对肝细胞肝癌细胞克隆形成能力和生长曲线的影响。
[0013]图3展示了雌激素对肝细胞肝癌细胞HepG2肝内生长以及细胞内Ki67和PCNA表达的影响。
[0014]图4展示了雌激素对小鼠肝细胞肝癌发生的影响。
[0015]图5展示了雌激素对肝细胞肝癌细胞SMMC7721和!fepG2凋亡的影响。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
[0017]实施例1:
本发明所涉及的雌激素片剂的制备:
取17 β-雌二醇20g，加入制备片剂的常规辅料180g，混匀，并用常规压片机制备成片剂1000片。
[0018]实施例2:
本发明所涉及的雌激素胶囊剂的制备:
取17 β -雌二醇20g，加入制备胶囊剂的常规辅料180g，混匀，并装胶囊制备成胶囊剂1000 粒。
[0019]实施例3:本发明所涉及的雌激素丸剂的制备: 取17 β-雌二醇20g，加入制备丸剂的常规辅料180g，混匀，制备成丸剂1000丸。
[0020]实施例:4:
本发明所涉及的雌激素注射液的制备:
取17 β -雌二醇lg，加入2ml无菌的溶液制备成雌激素注射液。
[0021]下面通过具体的药效学实验来进一步说明雌激素及其受体激动剂在抗肝细胞肝癌药物中的活性。
[0022]实验例1:雌激素对人的肝细胞肝癌细胞增殖的影响:
我们选用了 10株人的肝细胞肝癌细胞株，分别在体外与不同剂量的17 β -雌二醇(Ε2)培养 24、48 和 72 小时，通过 MTT [(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, 3- (4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐】方法分析不同剂量的17β-雌二醇(E2)在与这些细胞作用不同时间后对这些肝细胞肝癌细胞增殖的影响。MTT方法是一种常用检测细胞存活和增殖的方法，已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验等。结果显示17 β -雌二醇呈剂量和时间依懒性地抑制了人的肝细胞肝癌细胞的增殖(见图1)。
[0023]图1展示了雌激素对人肝细胞肝癌细胞SMMC7721、H印G2、BEL7404、Huh7、MHCC-97L、MHHCC-97H、PLC/PRF/5、SK-HEP-1、HCCLM3 和 BEL7402 细胞增殖的影响。17 β -雌二醇(Ε2)呈剂量和时间依赖性地抑制了人肝细胞肝癌细胞的增殖。在每一系列中η = 6。
[0024]实验例2:雌激素对人的肝细胞肝癌细胞的克隆形成能力和生长曲线的影响: 肿瘤的生长、转移、复发均以克隆原细胞(干细胞)的增殖为基础。集落形成实验反映了单个克隆活细胞的增殖能力，是测定抗癌药活性最可靠的指标。我们进一步选用人的肝细胞肝癌细胞SMMC7721和H印G2通过平板克隆形成实验研究雌激素对肝细胞肝癌细胞克隆形成能力的影响。在细胞与17β-雌二醇(Ε2)作用2周后，结果显示随着17 β-雌二醇(Ε2)浓度的升高，人肝细胞肝癌细胞SMMC7721和H印G2的集落形成能力逐渐下降。在17 β-雌二醇5 μ M和10μ M组，在两个细胞株都完全没有集落形成(见图2中A部分)。提示雌激素对人肝细胞肝癌细胞HepG2及SMMC-7721的克隆原细胞具有明显抑制作用。
[0025]我们进