一种三维管状多细胞结构的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明是通过细胞自组装来制备三维管状多细胞结构的方法，涉及生物制造与组织工程的使能技术，特别是管状多细胞结构体外构建的技术领域。
【背景技术】
[0002]实现生物组织的修复和再生是组织工程的主要目标。为实现组织乃至器官的功能再生，越来越多的研宄人员设计并制造各种人工替代结构体并将其广泛应用于生物组织工程，且此类制造逐渐向着更为复杂和精细的方向发展。具有管状结构的生物组织(比如气管、血管、淋巴管以及肠等)在高等生物体内广泛存在。此类三维管状结构体的人造替代物通常需要采用特定的材料在体外构建相应的三维结构体，然后进行相应技术处理，进而得到与体内的管状组织形状接近的替代物，比如通过双层经编组织的纺织型人造血管(中国发明专利CN101069756A，2007)，管体上连续缎设有纹路的涤纶人造血管(实用新型CN201341972Y，2009)，在机织机上织造的机织人造血管(中国发明专利CN102920531A，2013)，以及由涤纶人工血管和支架人工血管连通组合形成的改良型支架人工血管(中国发明专利，CN104161605A, 2014)等。
[0003]此类管状的人造血管局部替代物都需要先制造出由纤维材料等外部材料构成的管状结构，然后再将其植入体内并与相应的人体组织形成良好连接和融合，进而完成实现人造血管的血液输运功能。然而，此类管状结构体虽然制造精细，但由其本身的材料仍是一些人工合成材料(非生物体自身的组织)，因而仍然很有可能引起人体的排异反应以及不可预料的并发症等问题。虽然近年来一些国外研宄者运用化合高分子材料结合能够较好抵抗排异反应的生物分子制作出了一些特殊的“印刷墨水”，并利用基于该“印刷墨水”的3D打印技术制造出人造血管替代物，但这种方法的实施过程复杂，且成本很高。
[0004]因此，如果能够充分利用生物体自身细胞的自我组织(self-organizing)特性，构建特定的微环境进行干细胞的体外三维培养，使来源于人体自身的干细胞自组装成一种模拟天然生物组织的管状多细胞结构，且无需由合成材料制备的管状人工替代物，这样就能够从根本上大大减轻人体的排异反应，并大幅度降低人工血管或其他人工管状组织的制造成本。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是针对目前管状的人造血管局部替代物制造和实施过程复杂，成本高，而且带来人体排异反应的概率较大等缺点，提供一种通过干细胞在体外特定凝胶微结构中的三维培养制备出三维管状多细胞结构的方法。此方法将大量细胞至于水凝胶中培养，使其在三维空间伸展、迀移并相互连接，并在两种水凝胶的界面处形成中空管状的类似血管的结构(结构完全由细胞构成，不含其它任何材料)。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
[0007]该方法通过构建由具有不同机械特性和不同分子扩散率的上层水凝胶(I)与下层水凝胶(2)组成的复合水凝胶结构，并对水凝胶中的细胞进行三维培养，即可使细胞在上下层水凝胶的分界面附近自组装成为直管状结构(4)或弯曲管状结构(5)。
[0008]具体步骤如下:
[0009]A:将包含细胞的下层水凝胶(2)的前体溶液在具有特定微结构的模具上进行固化，形成固化型水凝胶结构，所述的模具是聚二甲基硅氧烷PDMS模具。
[0010]B:将包含细胞的上层水凝胶⑴的前体溶液通过移液器置于步骤(A)中的固化型水凝胶之上，对其进行凝固化处理，形成上下两层水凝胶粘合而成的复合式水凝胶。
[0011]C:将步骤(B)中的细胞进行三维培养，即可在上下层水凝胶的分界面附近自组装成为直管状结构(4)或弯曲管状结构(5)。
[0012]该方法需要使用具有不同结构特性的两种凝胶来构造特定的水凝胶界面，并且两种凝胶内包含细胞的浓度不相同，或者只有一种凝胶中含有细胞。利用细胞因子在不同结构特性(例如凝胶内部成分的浓度或比例不同)的水凝胶中扩散率的不同，使其在界面处出现累积并使之局部浓度增大；利用界面附近细胞的浓度梯度作用，使得细胞发生跨界面移动趋势，并使细胞在界面处的浓度增大，实现细胞因子和细胞在界面处的初步聚集。这就使得界面处的细胞和细胞因子(含活化子和阻滞子)的局部浓度会明显高于其他区域。然后，利用凝胶微系统中的大分子反应扩散过程中的图灵不稳定性，经过特定时间的细胞三维培养，使得活化子和阻滞子的浓度沿着界面交线方向的均匀分布状态被打破，并逐渐构建出许多分布的局部高浓度区域，这些局部区域的几何形状接近柱状体(一种三维图灵斑图，这里简称柱状聚集区域)。在此之后，利用细胞的趋化移动特性，使得大量细胞逐渐向界面处的各个柱状区域聚集，形成多个柱状多细胞聚集体，同时细胞在这些紧凑的局部区域内大量分泌活化子和阻滞子。当细胞聚集到一定程度之后，根据活化子自催化生成的规律，活化子在局部位置的浓度明显升高会导致活化子的产出趋于饱和(即其浓度接近饱和，增长明显放缓)，且其在中心区域内活化子的浓度梯度明显降低，这就会导致在各个柱状聚集区域中心部分的细胞趋化作用明显减小，这同时使得细胞的扩散作用占据了主导地位(扩散作用和趋化作用分别使细胞向正反两个方向移动，因此是此消彼长的关系)，于是整个柱状区域内细胞整体上逐渐由中心向外围扩散并在中心区域形成空腔。
[0013]随着中心区域的细胞向外围扩散，管壁区域的细胞增多，细胞趋化移动的方向开始反向，变为由中心向着管壁的方向并逐渐增大；但同时随着管壁区域活化子浓度增大并趋于饱和，以及细胞在管壁区域进一步增多，由中心朝向管壁的细胞趋化移动又开始逐渐减小，而由管壁朝向中心方向的扩散作用再次占据主导地位，细胞又开始向中心区域移动，但移动的距离范围更小，远不能到达中心区域。之后，细胞沿着管半径方向的迀移过程将多次重复上述过程，细胞在管半径方向上的迀移将来回多次，且幅度越来越小，最后逐渐到达平衡位置，于是多细胞中空管状结构趋于稳定。经过延时培养少数几天即可使得多细胞管状结构周围和中部的凝胶尽可能完全被细胞分泌的酶降解掉。于是，经过若干天的细胞三维培养，上述柱状多细胞聚集体最终形成中空的管状结构。管状多细胞结构的直径与相邻界面的距离相关；管状多细胞结构的长度与水凝胶二维界面的高度相关。
[0014]本发明提供的三维管状多细胞结构的制备方法中的水凝胶界面通过两种具有不同性质的水凝胶上下粘结形成。下层水凝胶的上表面具有阵列式的凹凸相间的图案；上层水凝胶的下表面也具有阵列式的凹凸相间的图案，且与下层水凝胶的上表面的凹凸结构互补地无缝粘结。下层的水凝胶和上层的水凝胶粘结形成的复合水凝胶结构整体浸入细胞培养基中，并每隔一天或两天更换新鲜培养基，经过若干天的长期培养之后，即可以在上下层水凝胶的界面附近制备出管状三维多细胞结构。
[0015]作为对本发明的限定，本发明所述的上层水凝胶和下层水凝胶可以是纤维蛋白凝胶、基底膜基质凝胶、透明质酸凝胶或者其他适于细胞生长的水凝胶。所述的细胞为间充质干细胞、间充质干细胞与上皮细胞的组合或间充质干细胞与内皮细胞的组合。
[0016]在初始情况下，细胞被均匀的包裹于上层水凝胶和下层水凝胶中，且细胞在上层水凝胶和下层水凝胶中的密度是不同的，且二者密度至少相差一倍。而且上层水凝胶和下层水凝胶之间的界面是连续的凹凸曲面，或者是水平与竖直面交替的连续界面，这种连续界面是周期性的或非周期性的。
[0017]作为对本发明的进一步限定，上层水凝胶和下层水凝胶之间的局部界面是水平面、竖直面或曲面。
[0018]采用本发明的方案后，取得的有益效果是:
[0019]本发明所提出的这种三维管状多细胞结构的构建方法完全依靠细胞的自组装，完全省去了目前已有的管状多细胞结构制备方法中所必需的外部结构材料及复杂的加工制作工艺，整个制备方法更充分的利用了大量细胞之间的相互通讯能力，并更接近于体内组织的天然形成过程，为人造管状组织的制备提供了一种更接近体内天然组织、可靠性高的方法。
[0020]而且本发明中的三维管状多细胞结构是在不同水凝胶的界面处制备出中空管状的类似血管的结构，该结构完全由细胞构成，不含其它合成材料，能够大大减轻目前管状人造组织所需的由聚合物制造的替代物所带来排异反应的问题，并能够大幅度降低人工血管或其他