抗药性癌细胞的抑制的制作方法
【专利说明】抗药性癌细胞的抑制
[0001] 领域
[0002] 所提供的是使用组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase, HDAC)抑制剂抑制或防 止抗药性癌细胞生长的方法。在一个实施方案中，HDAC抑制剂是罗米地辛。
[0003] 背景
[0004] 对抗癌药物的抗性代表成功癌症治疗的主要障碍。各种抗性机制和替代存活 途径已有描述（Redmond等人，Front Biosci 13:5138-5154,2008)。最新发现揭示出抗 药性的非突变性机制。Trumpp 和 Wiesletler(Nat Clin Prac Oncol 5,337-347,2008) 描述了可通过增强的药物流出而内在地更顽固对抗多种抗癌药物作用的"癌症干细胞" 的一个小群体。其他研宄牵涉到外遗传机制，提示获得性抗药性不一定需要稳定的可 遗传的基因改变（Glasspool等人，Br J Cancer, 94:1087-1092, 2006)。在对用表皮 生长因子受体（EGFR)酪氨酸激酶抑制剂（TKIs)治疗反应良好及后来经历治疗失败的 非小细胞肺癌（NSCLC)患者中得到证明，但是又证明在"药物假日（drug holiday)"后 对 EGFR TKI 再治疗有二次反应（Kurata 等人，Ann Oncol 15:173-174, 2004 ;Yano 等 人，Oncol Res 15:107-111,2005)。对若干其他抗癌药物良好建立了类似的再治疗反应 (Cara&Tannock, Ann Oncol 12:23-37,2001)。这些发现提示对癌症药物的获得性抗性涉及 可逆的"耐药性（drug-tolerant) "状态。
[0005] 最新的数据指出称为耐药性存留（drug-tolerant persisters, DTPs)细胞的癌 细胞亚群体的先存性，耐药性存留（DTPs)细胞表现出对高浓度的化疗药物的外遗传介导 的抗性（Sharma等人，Cell 141:69-80,2010)。虽然DTPs多半是休眠的，但是这些细胞 中有一小分部恢复生长，甚至在100X IC5tl药物浓度存在下，从而产生耐药性扩增的存留 (drug-tolerant expanded persisters, DTEPs)细胞。组蛋白 H3 赖氨酸 4(H3K4)甲基化和 H3K14乙酰基化的水平在DTPs和DTEPs中显著降低。
[0006] 由于对抗癌药物的抗性仍然是抗癌疗法中的主要挑战，因此存在对能够克服这种 抗性的化合物的需求。
[0007] 概述
[0008] 在一个实施方案中，本文提供的是通过克服癌细胞对药物的抗性来治疗癌症患者 的癌症的方法，包括向所述患者给予有效量的（i) EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑 制剂，和（ii)HDAC抑制剂。在一个实施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑制 剂以及HDAC抑制剂同时给予。在另一个实施方案中，HDAC抑制剂在用EGFR酪氨酸激酶抑 制剂或B-Raf激酶抑制剂预治疗之后给予。
[0009] 在另一个实施方案中，本文提供的是用于克服患者的癌细胞的抗药性的方法，包 括向所述患者给予有效量的（i)EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑制剂，和（ii)HDAC 抑制剂。在一个实施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑制剂以及HDAC抑制 剂同时给予。在另一个实施方案中，HDAC抑制剂在用EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激 酶抑制剂预治疗之后给予。
[0010] 用于本文提供的方法中的HDAC抑制剂包括但不限于曲古抑菌素 A(richostatin A) (TSA)、伏林司他（Vorinostat) (SAHA)、丙戊酸（Valproic Acid) (VPA)、罗米地辛 (romidepsin)和MS-275。在一个实施方案中，HDAC抑制剂是罗米地辛。
[0011] 在另一个实施方案中，所述药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂。适合用于本文提 供的方法中的EGFR酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于厄洛替尼（Erlotinib)、吉非替尼 (Getifinib)、拉帕替尼（Lapatinib)、阿法替尼（Afatinib)、卡纳替尼（Canertinib)、来那 替尼（Neratinib)、培利替尼（Pelitinib)、CP-724714、CUDC-101 和 WZ4002。在一个实施方 案中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂是厄洛替尼。
[0012] 在又一个实施方案中，所述药物是B-Raf激酶抑制剂。适合用于本文提供的方 法中的B-Raf激酶抑制剂包括但不限于维罗非尼（Vemurafenib) (PLX4032)、索拉非尼 (Sorafenib) (AZ628)、达拉非尼（Dabrafenib)、PLX4720、⑶C-0879、RAF-265 和 SB690885。 在一个实施方案中，B-Raf激酶抑制剂是维罗非尼。在另一个实施方案中，B-Raf激酶抑制 剂是索拉非尼。
[0013] 在一个实施方案中，可通过本文提供的方法治疗的癌症是实体肿瘤。在一个实施 方案中，所述癌症是皮肤癌。在另一个实施方案中，所述癌症是肺癌。
[0014] 在一个实施方案中，本文提供的是用于抑制或防止对EGFR酪氨酸激酶抑制剂或 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-Raf(B-Raf)激酶抑制剂有抗性的耐药性存留细胞（DTP)增殖 的方法，包括使DTPs接触（i) EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑制剂，和（ii) HDAC抑 制剂。在一个实施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑制剂以及HDAC抑制剂 同时添加到癌细胞中。在另一个实施方案中，所述癌细胞在与EGFR酪氨酸激酶抑制剂或 B-Raf激酶抑制剂接触之后用HDAC抑制剂治疗。
[0015] 在一个实施方案中，本文提供的是用于抑制或防止对EGFR酪氨酸激酶抑制剂 或B-RAF激酶抑制剂有抗性的耐药性扩增的存留细胞（DTEP)的集落形成的方法，包括使 DTEPs接触（i)EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑制剂，和（ii)HDAC抑制剂。在一个 实施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑制剂以及HDAC抑制剂同时添加到癌 细胞中。在另一个实施方案中，所述癌细胞在与EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑制 剂接触之后用HDAC抑制剂治疗。
[0016] 在一个实施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂是任何EGFR酪氨酸激酶抑制剂。适 合用于本文提供的方法中的EGFR酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼、拉 帕替尼、阿法替尼、卡纳替尼、来那替尼、培利替尼、CP-724714、CUDC-101和WZ4002。在一个 实施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂是厄洛替尼。
[0017] 在一个实施方案中，B-Raf激酶抑制剂是任何B-Raf激酶抑制剂。适合用于本文 提供的方法中的B-Raf激酶抑制剂包括但不限于维罗非尼（PLX4032)、索拉非尼（AZ628)、 达拉非尼、PLX4720、⑶C-0879、RAF-265和SB690885。在一个实施方案中，B-Raf激酶抑制 剂是维罗非尼。在另一个实施方案中，B-Raf激酶抑制剂是索拉非尼。
[0018] 用于本文提供的方法中的HDAC抑制剂包括但不限于曲古抑菌素 A(TSA)、伏林司 他（SAHA)、丙戊酸（VPA)、罗米地辛和MS-275。在一个实施方案中，HDAC抑制剂是罗米地 辛。
[0019] 在一个实施方案中，本文提供的是用于治疗患者的抗药性癌症的药物组合物。在 一个实施方案中，所述药物组合物包含（i) EGFR酪氨酸激酶抑制剂或B-Raf激酶抑制剂， 和（ii)HDAC抑制剂。在一个实施方案中，HDAC抑制剂是罗米地辛。在另一个实施方案中， EGFR酪氨酸激酶抑制剂是厄洛替尼。在又一个实施方案中，B-Raf激酶抑制剂是维罗非尼。 在又一个实施方案中，B-Raf激酶抑制剂是索拉非尼。
[0020] 参照发明详述和实施例可以更全面地理解本实施方案，这些实施例旨在具体说明 非限制性的实施方案。
[0021] 附图简述
[0022] 图1显示AZ628和罗米地辛的组合对黑色素瘤细胞系（M14)中的DTEP突现 (emergence)的影响。在"连续"时间表（45天）期间，在2 μΜ(对于AZ628)和0· 5nM(对 于罗米地辛）的浓度下，每3天将两种药剂加入到细胞中。在选择日，使用CellTiter-Gl0 测量细胞活力。
[0023] 图2显示厄洛替尼和罗米地辛的组合对非小细胞肺癌细胞系（HCC827)中的DTEP 突现的影响。在"连续"时间表（27天）期间，在2 μΜ(对于厄洛替尼）和1.0 nM(对于罗 米地辛）的浓度下，每3天将两种药剂加入到细胞中。在选择日，使用CellTiter-Glo测量 细胞活力。
[0024] 图3A和3B描绘有限数目的罗米地辛剂量对防止黑色素瘤细胞系M14中的DTEP 生长的影响。罗米地辛以〇. 5nM的浓度使用，AZ628以2 μΜ的浓度使用。图3C描绘有限 数目的罗米地辛剂量对防止非小细胞肺癌细胞系（HCC827)中的DTEP生长的影响。罗米地 辛以1.0 nM的浓度使用，厄洛替尼以2 μ M的浓度使用。
[0025] 图4Α显示6小时罗米地辛暴露（洗脱（wash-out))对防止黑色素瘤细胞系（Μ14) 中的DTEP生长的影响。将罗米地辛和AZ628每3天分别以0. 5nM和2 μ M的浓度加入到细 胞培养物中，同时无洗脱。在洗脱实验中，在添加药物后6小时，从细胞中吸出含有ΑΖ628 和罗米地辛的条件培养基并且更换为含有ΑΖ628的培养基。罗米地辛以0. 5ηΜ(Α)、2ηΜ(Β) 或IOnM(C)的浓度使用。图4Β显示6小时罗米地辛暴露（洗脱）对防止非小细胞肺癌细 胞系（HCC827)中的DTEP生长的影响。将罗米地辛和厄洛替尼每3天分别以1.0 nM和2 μΜ 的浓度加入到细胞培养物中，同时无洗脱。在洗脱实验中，在添加药物后6小时，从细胞中 吸出含有厄洛替尼和罗米地辛的条件培养基并且更换为含有厄洛替尼的培养基。罗米地辛 以1、5和20ηΜ的浓度使用。
[0026] 图5显示在非小细胞肺癌细胞系（HCC827)中，在用厄洛替尼预治疗之后，罗米地 辛对防止DTEP突现的影响。条件培养基每三天更换为新鲜的含有药物的培养基。在第12 天，将罗米地辛以InM的浓度加入到含有药物的培养基中。
[0027] 详述
[0028] 定义
[0029] 应当理解，以上一般性描述和以下详细描述仅仅是示例性的和解释性的且不构成 对请求保护的任何主题的限制。在本申请中，单数的使用包括复数，除非另有明确说明。必 须注意到，如英文说明书和附上的权利要求书中所使用的，不定冠词"a"和"an"（ "一个"、 "一种"及定冠词"the"（ "该"）包括复数形式以及单数所指物，除非正文中另外清楚地指 明。还应当注意到，"或"的使用意指"和/或"，除非另有说明。此外，术语"包括"以及其 他形式（例如，"包含"、"含有"）的使用不是限制性的。
[0030] 术语"癌症"是指皮肤组织、器官、血液和血管的疾病，包括但不限于膀胱、骨或血 液、脑、乳腺、子宫颈、胸、结肠、子宫内膜、食管、眼、头、肾、肝脏、淋巴结、肺、口、颈、卵巢、胰 腺、前列腺、直肠、胃、睾丸、咽喉和子宫的癌症。
[0031] 如本文所用的术语"增殖性紊乱或疾病"是指在多细胞生物体中的细胞的一个 或多个亚群（subset)不需要的细胞增殖，从而导致对该多细胞生物体有害（即，不适或 预期寿命减少）。例如，如本文所用的，增殖性紊乱或疾病包括赘生性疾病（neoplastic disorders)和其他增殖性疾病（proliferative disorders) 〇
[0032] 如本文所用的术语"增殖"是指细胞（例如癌细胞）分裂的快速和重复演替。
[0033] 如本文所用的术语"化学抵抗性癌症（chemoresistant cancer) "意指一直对某种 疗法有反应，然后因为癌细胞对化学疗法的作用无反应而开始生长的癌症类型。
[0034] 如本文所用的术语"黑色素瘤"意指黑色素细胞的恶性肿瘤。黑色素瘤起源于黑 色素细胞主要存在的皮肤，但也可以起源于身体中含有黑色素细胞的任何部位。
[0035] 如本文所用的术语"非小细胞肺癌"是指除小细胞肺癌以外的任何类型的上皮性 肺癌。
[0036] 如本文所用的术语"治疗"意指与紊乱或疾病（例如，癌症或肿瘤综合征）相关的 症状的整体或部分减轻，或者使那些症状的进一步进展或恶化减慢或停止。
[0037] 如本文所用的术语"抑制"意指使细胞或细胞系（例如，癌细胞或癌细胞系）的生 长减慢或降低。
[0038] 如本文所用的术语"防止"意指细胞或细胞系（例如，癌细胞或癌细胞系）的生长 不存在或缺乏。
[0039] 如本文所用的术语"突现（emergence) "意指癌细胞群体中的抗药性癌细胞的出现 (occurrence)或复现（recurrence) 〇
[0040] 术语"药物"、"治疗剂"和"化学治疗剂"是指给予对象以治疗、预防或减轻病症、 紊乱或疾病的一种或多种症状的化合物或其药物组合物。
[0041] 如本文所用的术语"耐药性存留细胞（drug-tolerant persisters, DTPs) "是指对 高浓度的化疗药物具有耐受性的癌细胞，即，当药物以比IC5tl高数百倍的浓度使用时，对癌 症药物治疗具有抗性的癌细胞。
[0042] 如本文所用的术语"耐药性扩增的存留细胞（drug-tolerant expanded persisters，DTEPs) "是指能够在高浓度的连续癌症药物治疗下增殖的癌细胞。
[0043] 如本文所用的术语"癌细胞"是指以不受调节的、加快的节奏生长和分裂的任何来 源的细胞。
[0044] 如本文所用的术语"癌细胞系"是指从原代癌细胞建立的细胞系，其中所有的细胞 都具有相同的特性。
[0045] 如本文所用的术语"药物"、"治疗剂"和"化学治疗剂"是指给予对象以治疗、预防 或减轻病症、紊乱或疾病的一种或多种症状的化合物或其药物组合物。
[0046] 如本文所用的术语"表皮生长因子受体（epidermal growth factor rec印tor，EGFR) "是指表皮生长因子家族（EGF-家族）成员的细胞表面受体。
[0047] 如本文所用的术