肠病毒71的冷适应型温度敏感株及开发冷适应型温度敏感性病毒株的方法
【专利说明】肠病毒71的冷适应型温度敏感株及开发冷适应型温度敏 感性病毒株的方法
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[0003] 发明背景
[0004] 本发明涉及冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株，特别涉及冷适应型温度敏感性 肠病毒71毒株EV71 :TLL β P20和EV71 :TLL α P20。本发明还涉及开发冷适应型温度敏感 性病毒株、特别是RNA病毒株的方法。
[0005] 本文用于描述本发明背景或者提供关于实践的额外细节的出版物及其它材料引 入本文并且为方便起见集合在参考文献中。
[0006] 手足口病（HFMD)是由一组基本上属于肠病毒A物种（enterovirus species Α)的 人肠病毒导致的。在这些病毒中，肠病毒71(EV71)和柯萨奇病毒A16(CA16)负责导致90% 以上的HFMD病。除了导致HFMD之外，已知EV71导致产生死亡的严重神经疾病，特别是在 幼儿中。
[0007] 人肠病毒71 (EV71)是小的无包膜病毒，大小约30nm，具有大约7450个核苷酸的单 链正RNA基因组。该病毒分类为小RNA病毒科（Picornaviridae)肠病毒属（Enterovirus) 的人肠病毒A物种（Alexander et al.，1994 ;Melnick，1996)。基于其主要衣壳蛋白（VPl) 基因的系统发生分析，EV71分为3个主要基因群（命名为A、B和C)，基因群B和C进一步 分为基因亚群B1-B5及Cl-C5(Bible et al.，2008)。EV71与一组临床疾病相关，包括主要 在婴儿和幼儿中的手足口病（HFMD)、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样麻痹（Alexander et al.，1994 ;Melnick，1996)。该病毒首先从美国加利福尼亚的一名患有无菌性脑膜炎的 儿童中分离，随后被鉴定为肠病毒属的新血清型（Schmidt et al.，1974)。在其最初分离 后几年中，在世界各个部分均报道了这个病毒导致的具有并发症的HFMD的爆发（Blomberg et al.，1974 ;Kennett et al.，1974 ;Deibel et al. , 1975 ；Hagiwara et al.，1978)〇
[0008] 近年来，在发生神经毒性EV71流行性和零星爆发后，EV71感染已成为全世界特 别是亚太地区主要的公共健康负担和关注点。EV71的神经毒性在1975年保加利亚爆发 期间首先获得显著的全球关注，该次爆发导致705例脊髓灰质炎样疾病，其中44例死亡 (Chumakov et al·，1979 ;Shindarov et al·，1979)。1978 年在匈牙利发生类似性质的爆 发，导致许多脊髓灰质炎样疾病病例及47例死亡（Nagy et al.，1982)。随后，在纽约、香 港、澳大利亚和费城报道了一些与EV71相关的较温和的CNS疾病的流行（Chomnaitree et al·，1958 ;Samuda et al·，1987 ;Gilbert et al·，1988 ;Hayward et al·，1989)。在日本 发生了两起EV71流行，大部分病例的特征是HFMD及CNS疾病的低发生率（Tagaya et al.， 1981 ;Ishimaru et al.，1980 ;Hagiwara et al.，1983)。在 1997 年，在马来西亚出现由于 高神经毒性EV71导致的HFMD大爆发，导致48例死亡。更大的爆发在1998年发生在台湾， 有超过100000例HFMD，405例严重感染，78例由于急性脑干脑脊髓炎伴神经性心衰和肺水 肿而导致的死亡（Lum et al.，1998a ;Lum et al.，1998b ;Chang et al.，1998 ;Yan et al.， 200 ;Liu et al·，2000 ;Wang et al·，2000)。在 2008 年中国大陆记录了 488955 例 HFMD 病例，其中126例死亡（Chinese Center，2008)。据报道2009年HFMD病例数增至1155525 例，死亡353例（Yang et al.，2011)。2010年，该国经历了最大爆发，有超过170万HFMD 病例，27000例患者具有严重神经学并发症，905例死亡。在所有3次爆发中，几乎所有具有 神经学并发症和死亡的严重病例均由EV71所致（Zeng et al.，2012)。
[0009] 目前，病毒毒力的分子决定簇及EV71感染的发病机制仍未完全了解。没有任何抗 病毒药被批准用于临床治疗严重感染及相关神经学并发症，也没有任何疫苗可供用于控制 和预防复发性爆发。在控制和预防策略方面，特别用于发展中国家的成本可取的疫苗的开 发是顶级优先和最紧急的。处于研宄和开发中的各种类型的抗EV71疫苗看起来在啮齿类 或猴中引起免疫应答（Wu et al.，2001 ;Arita et al.，2005 ;Chiu et al.，2006 ;Arita et al. ，2007 ;Tung et al. ，2007 ;Chung et al. ，2008 ;Chen et al. ，2008 ;Ong et al. ，2010 ; Chen et al.，2011;Lee and Chang，2010;Xhang et al.，2010.尽管基于 VPl 衣壳的病毒 样颗粒疫苗和亚单位肽疫苗是值得进一步研宄和开发的可行的潜在疫苗策略，但是基于失 活的可注射Salk及减毒的口服活Sabin脊髓灰质炎病毒疫苗在控制和接近根除野生型脊 髓灰质炎感染中的过去非常大量的开发和应用经验，可注射的失活和口服减毒EV71疫苗 是最有前景的候选者（Zhang et al.，2010)。
[0010] 目前，市场上没有疫苗能保护儿童抗EV71所致感染及手足口病。基于最近信息， 中国2个中心、新加坡1个中心及台湾1个中心在开发可注射失活EV71疫苗（新闻报道及 个人通讯）。日本东京的国家传染病研宄所的肠病毒部门由Dr H. Shimizu领导从1980年 代已对EV71在猴子中的发病机制及温度敏感性EV71株作为潜在的候选口服减毒活疫苗进 行了深入研宄（Arita et al.，2005;Arita et al.，2007)。在其猴子研宄中EV71温度敏 感株的所有潜在疫苗候选物在静脉内接种后仍能导致CNS的神经侵袭和组织病理学损害， 尽管与野生型病毒相比程度较低。
[0011] 减毒活疫苗代表首次成功的接种方法之一，始自18世纪，当时英国医生Edward Jenner开始用牛痘病毒接种儿童以抵抗致命疾病天花。减毒活疫苗使用活病毒或微生物， 它们已被弱化从而不能致病，但是诱导保护性免疫应答。传统的、经典的及遗传学方法已在 某种程度上成功减毒病毒和微生物用作减毒活疫苗 4448。传统方法使用天然发生的在人类 中无毒力的相关生物，如使用牛痘病毒或痘苗病毒。经典方法涉及在减毒条件下毒性病毒 或微生物的生长循环，例如在组织培养或苛性液体培养基中。遗传学方法使用分子生物技 术操作基因组以降低它们的毒力（Huygelen，1997 ;Robinson，2008 ;Coleman et al.，2008 ; Lauring et al·，2010 ;Kenney et al·，2011)。在获得作为减毒标记的温度敏感性表型病 毒的经典方法中，野生型病毒是经噬斑测定技术而噬斑选择的，其是在低温保温的合适细 胞中培养病毒。选择的病毒株随后在靶向的低保温温度重复传代（Hagiwara et al.，1982; Hashimoto and Hagiwara, 1983 ；Richman and Murphy，1997)〇
[0012] 希望的是开发能用于治疗病毒疾病的病毒株，其在特异性体外细胞培养条件中保 持表型和遗传稳定性，并且在静脉内接种后在猴子中不显示神经毒性。还希望的是开发病 毒、包括RNA病毒的冷适应型温度敏感性病毒株，其在细胞培养中系列传代后衍生。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明涉及冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株，特别涉及冷适应型温度敏感性 肠病毒71毒株EV71 :TLL β P20和EV71 :TLL α P20。本发明还涉及开发冷适应型温度敏感 性病毒株、特别是RNA病毒株的方法。
[0015] 因此，在一个方面，本发明提供了冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株。在一个实 施方案中，所述冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株是本文描述的EV71 :TLLf3P20。在另一 个实施方案中，所述冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株是本文描述的EV71 :TLLa P20。
[0016] 本发明的肠病毒71毒株通过用温度敏感性作为表型标记减毒肠病毒71的方法制 备。所述方法是体外实验室方法，改变病毒的生物学生长特征以适应在低于30°C的保温温 度的最佳复制。以下详细描述的适应方法如下进行，即以系统性逐步方式渐进降低培养病 毒的保温温度，直至达到选择用于病毒最佳复制的靶向温度。
[0017] 在第二个方面，本发明提供了包含本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒 株的组合物。在一个实施方案中，组合物包含有效量的本文描述的病毒株。在另一个实施 方案中，所述组合物包含一或多种生理学或药物学可接受的载体。在进一步的实施方案中， 所述组合物是疫苗。含有本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的疫苗使用本领 域技术人员公知的技术制备。通过使用本领域技术人员公知的技术将疫苗给予对象如人类 对象，这种疫苗用于提供抗亲本病毒株的免疫性。
[0018] 在第三个方面，本发明提供了在对象如人类对象中引起保护性免疫应答的方法， 其包括给予对象预防或治疗或免疫学有效量的本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71 毒株。在一个实施方案中，保护性免疫应答保护对象抗肠病毒71导致的疾病。在一个实施 方案中，所述疾病是手足口病。在另一个实施方案中，所述疾病是无菌性脑膜炎。在一另外 的实施方案中，所述疾病是脑炎。在进一步的实施方案中，所述疾病是脊髓灰质炎样麻痹。 在一个实施方案中，本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株作为疫苗给予。在一另 外的实施方案中，对象已暴露于野生型肠病毒71。在另一个实施方案中，给予本文描述的冷 适应型温度敏感性肠病毒71毒株预防对象如人类对象被肠病毒71相关疾病累及。在一另 外的实施方案中，对象已暴露于野生型肠病毒71。在进一步的实施方案中，给予本文描述的 冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株延迟了病毒感染的对象如人类对象中肠病毒71相关疾 病的发作或减缓了所述疾病的进展速度。
[0019] 在第四个方面，本发明提供了用温度敏感性作为表型标记减毒病毒的方法。根据 这个方面，所述方法开发了冷适应型温度敏感性病毒株。本发明方法是体外实验室方法， 以改变病毒生物学生长特征以适应在30°c以下的保温温度的最佳复制。适应方法如下进 行，即以系统性逐步方式渐进降低培养病毒的保温温度，直至达到选择用于病毒的最佳复 制的靶向温度。因此，根据本发明，所述方法包括下述步骤：（i)制备亲本野生型病毒参考 原种（reference stock)，（ii)保温用亲本野生型病毒参考原种以较高感染复数（MOI)感 染的细胞培养物，保温温度大约34°C至大约36°C，优选大约34°C，保温5代或更多代，直至 每一代获得完全细胞病变效应（CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代 获得完全CPE，（iii)保温用前一步骤所得的病毒以较高MOI感染的细胞培养物，保温温度 比前一步骤低大约1°C至大约3°C，保温5代或更多代，直至每一代获得完全细胞病变效应 (CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代获得完全CPE，及（iv)以系统性 逐步渐进降低保温温度的方式而重复步骤（iii)，直至达到选择用于病毒的最佳复制的靶 向温度。在一个实施方案中，靶向温度是大约26°C至大约29°C，优选大约28°C。在一个实 施方案中，渐进降低保温温度是降低大约l°c至大约2°C的温度。
[0020] 在一个实施方案中，亲本野生型病毒参考原种是通过在大约36°C至大约38°C、优 选大约37°C的温度保温用野生型病毒感染的细胞培养物一代或两代直至获得完全细胞病 变效应（CPE)而制备。含有产生的病毒的培养物上清等份置于小瓶中或者其它合适储存装 置中。这个培养物上清用作亲本野生型病毒参考原种。参考亲本野生型病毒用于后续减毒 过程。在另一个实施方案中，亲本野生型病毒参考原种等份储存在合适温度，如_80°C。
[0021] 在一个实施方案中，病毒是任何病毒。在另一个实施方案中，病毒是RNA病毒。在 一另外的实施方案中，RNA病毒是正链RNA病毒。在进一步的实施方案中，病毒是小RNA病 毒科成员。在另一个实施方案中，病毒是肠病毒属成员。在一个实施方案中，病毒是肠病毒 71 (EV71)。在另一个实施方案中，病毒是柯萨奇病毒A16(CA16)。本发明方法可用于产生任 何这些病毒的冷适应型温度敏感性病毒株，包括但不限于EV71和CA16的冷适应型温度敏 感株。
[0022] 在一个实施方案中，被病毒感染的细胞是任何允许病毒生长的细胞。在一优选的 实施方案中，细胞是Vero细胞（ATCC CCL-81)。在一个实施方案中，细胞通过在适合细胞生 长的培养基中定期传代而保持。在其中细胞是Vero细胞的实施方案中，Vero细胞在补加 10%胎牛血清（FCS)的Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM)中保持。在一个实施方案中， 在补加1 % FCS的DMEM中保持的Vero细胞用于生产亲本野生型病毒、病毒培养物、减毒、滴 定和评估温度敏感性表型。在另一个实施方案中，DMEM补加1%FCS，用于使病毒株适应在 相继降低的保温温度中复制。
[0023] 本发明还涉及通过本文描述的方法产生的冷适应型温度敏感性病毒株。通过本文 描述的方法产生的冷适应型温度敏感性病毒可用于使用本领域技术人员熟知的技术生产 疫苗。这种疫苗可用于通过用本领域技术人员熟知的技术给予对象疫苗而提供抗亲代病毒 株的免疫性。
[0024] 附图简述
[0025] 图Ia示出衍生自给予静脉内剂量的肠病毒71(EV71 :TLLf3P20)后第4天的猴血 液的外周血单核细胞（箭头），其用特异于该病毒的商业单克隆抗体经间接免疫荧光测定 染色阳性。
[0026] 图Ib示出GelRed染色的电泳琼脂糖凝胶的照片，其示出衍生自免疫后第4天的 猴子（2202F，2891F)的组织的使用特异于肠病毒71检测的寡核苷酸引物对一步RT-PCR 扩增产物。RT-PCR扩增产物的预期大小是427bp。两个凝胶中的泳道如下。凝胶1:泳道 I :100bp DNA梯；泳道2 :2202F-心脏；泳道3 :2202F-脾；泳道4 :2202F-淋巴结；泳道5 : 2202F-肾；泳道6 :2202F-肝；泳道7 :2891F-心脏；泳道8 :2891F-脾；泳道9 :2891F-淋 巴结；泳道10 :2891F-肾；泳道11 :2891F-肝；泳道12 :2202F-脑干（脑桥）；泳道13 : 2202F-脑干（延髓）；泳道14 :2202F-皮质（脑回）；泳道15 :2202F-脊髓（颈椎）；泳道 16 :2202F-脊髓（腰椎）；泳道17 :2202F-脊髓（胸椎）；泳道18 :2891F-脑干（延髓）；泳 道19 :2891F-脑干（脑桥）；泳道20 :2891F-皮质（左小脑）。凝胶2 :泳道21 :100bp DNA 梯；泳道22 :289IF-皮质（右小脑）；泳道23 :289IF-脊髓（颈椎）；泳道24 :289IF-脊髓 (腰椎）；泳道25 :2891F-脊髓（胸椎）；泳道26 :无模板对照；泳道27 :100bp DNA梯。
[0027] 发明