靶向抑制hotair的小rna在制备抗前列腺癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]近年来一些研宄表明非编码RNA(ncRNAs)与多种细胞途径有关，尤其是与肿瘤相关的增殖、凋亡以及转移等过程。microRNA是其中一类大约22个碱基左右的目前研宄最多的非编码RNA，可以在转录及转录后水平发挥调控作用。长链非编码RNA(LncRNA)则是另一类目前被研宄较多的非编码RNA。LncRNA为一类长度大于200个碱基的非编码RNA，参与了几乎与mRNA相关的所有过程，从转录到mRNA拼接，RNA降解和翻译。LncRNA的调节异常与人类疾病关系密切，尤其是肿瘤，它可能通过调节染色质修饰从而影响表观遗传学信息和肿瘤进展。
[0003]Hox 基因的反义基因间 RNA(Hox transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR)是目前研宄较多的一种IncRNA，由Rinn研宄小组首次发现并定义。HOTAIR长约2158个碱基，以反式沉默的方式发挥作用。有研宄表明HOTAIR能重塑染色质并且促进肿瘤的转移，在多个肿瘤中，HOTAIR被证明高表达，包括胰腺癌、大肠癌、肝癌、胃癌等。HOTAIR的高表达与表观遗传学有关，在胃癌中，它通过招募多聚梳抑制复合体(PolycombRepressive Complex 2，PRC2)，使组蛋白H3的K9和K27位点发生甲基化，从而调控靶基因的表达。而目前对于HOTAIR在前列腺癌中的研宄国内尚属空白，本研宄证明了 HOTAIR在前列腺癌细胞中表达上调，表明前列腺癌的发生发展可能与HOTAIR有关。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用。本发明包含多种序列的siRNA，这些小RNA能通过靶向抑制前列腺癌细胞中的HOTAIR表达，诱导肿瘤周期阻滞，抑制其侵袭迀移能力，进而可以应用于抗前列腺癌药物的制备。
[0005]所述靶向抑制HOTAIR的小RNA的核苷酸序列如下:
[0006]s1-H0TAIRl:5，-UUUUCUACCAGGUCGGUAC-3，，如 SEQ ID N0.1 所示；
[0007]s1-H0TAIR2:5，-AAUUCUUAAAUUGGGCUGG-3，，如 SEQ ID N0.2 所示。
[0008]进一步地，所述的抗前列腺癌药物还可以包括制剂允许的赋形剂。
[0009]本发明的有益效果是:
[0010]本发明采用小RNA即s1-HOTAIRl或si_H0TAIR2通过靶向抑制前列腺癌细胞中的HOTAIR表达，操作简单，成本较低；用量较少，50nM的转染浓度即可达到良好的抑制效果，抑制作用确切。
【附图说明】
[0011]图1A是HOTAIR在正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)和前列腺癌细胞(PC3、DU145)中的相对表达量；图1B是用siRNA抑制HOTAIR表达后HOTAIR的表达水平。数据均来源于3次独立实验的平均值和标准差；
[0012]图2是siRNA抑制HOTAIR表达后前列腺癌细胞的周期改变；数据均来源于3次独立实验的平均值和标准差；
[0013]图3是siRNA抑制HOTAIR表达后前列腺癌细胞的侵袭和迀移能力的改变；数据均来源于3次独立实验的平均值和标准差。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的分析。
[0015]实施例1:siRNA下调HOTAIR的表达并抑制前列腺癌细胞的生物学功能，实施方案:
[0016]1.细胞系:人正常前列腺上皮细胞RWPE-1，前列腺癌细胞系PC3，前列腺癌细胞系DU145(均来自于中科院上海细胞所)。
[0017]2.siRNA合成:siRNA均有上海吉凯生物技术有限公司化学合成。
[0018]3.实验分组:siRNA 组(s1-HOTAIRl、si_H0TAIR2)，对照组(s1-Control)
[0019]4.细胞培养:上述三种细胞用RPM1-1640培养基，然后在RPM1-1640培养基中加入10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素，置于37°C，含5% CO2的恒温培养箱中培养。
[0020]5.qRT-PCR检测:利用qRT_PCR技术检测3株细胞系中HOTAIR的表达水平。使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，使用PrimeScript反转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行qRT-PCR分析，结果使用磷酸甘油酸脱氢酶(GAPDH)进行标准化。
[0021]所述的HOTAIR 的 PCR 引物如下:上游引物:5’ -CATGGATCCACATTCTGCCCTGATTTCCGGAACC-3，，如 SEQ ID N0.3 所示，下游引物:5 ’ -ACTCTCGAGCCACACACACACACACCTACAC-3 ’，如SEQ ID N0.4所示；GAPDH 引物如下:上游引物:5’ -GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，如 SEQID N0.5所示，下游引物:5’ -GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’，如 SEQ ID N0.6 所示。
[0022]PCR反应条件为:94°C变性4min ;按下列参数循环28次:94°C变性45s，58°C退火45s，72°C延伸1min ;4°C停止反应。
[0023]使用ABI7500fast进行qRT-PCR和数据收集，采用2_ Δ Λ Ct进行数据分析。
[0024]6.细胞转染:H0TAIR(s1-H0TAIRl:5’-UUUUCUACCAGGUCGGUAC-3’，如SEQ ID N0.1所示；s1-H0TAIR2:5’ -AAUUCUUAAAUUGGGCUGG-3’，如 SEQ ID N0.2 所示)，s1-Control (5，-CUACAACAGCCACAACGUC[dT] [dT]_3)。将 s1-HOTAIRl、si_H0TAIR2 及 s1-Control 经过脂质体Lipofectamine 2000包裹后转入细胞，以6孔板为例(其余培养器皿根据底面积之间的比例调整试剂量)，每孔取7.5ul 20nM siRNA及siControl储存液和5ul脂质体分别溶于250ul无血清培养基，5分钟后混合，室温静置20分钟后加入培养板中，补充含血清培养基使其终浓度为50nM，置于六孔板培养48小时后收集进行后续实验。
[0025]7.细胞周期检测:细胞种植在六孔板中，按上述转染后收集细胞，用PBS洗2遍，每遍800g离心5分钟。用75%乙醇在4°C固定I小时，PBS洗一遍，重悬后加入碘化丙啶(PD试剂和RNA酶抑制剂，室温避光孵育30分钟。使用FC500流式细胞仪(BI b1science)进行检测。实验独立重复4次。
[0026]8.细胞侵袭实验:细胞种植在六孔板中，按上述转染后收集细胞，用无血清培养基重悬后细胞计数。在Transwell小室上室加入0.2ml悬液(约40000个细胞)，置于24孔板中，并在24孔板的孔中加入0.6ml含血清培养基。孵育24小时后收集小室，甲醇固定5分钟，PBS清洗2遍，0.1 %结晶紫染色5分钟后显微镜下观察。实验独立重复3次。
[0027]9.统计学分析:应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料两组之间比较采用t检验。以P〈0.05为差异有统计学意义。
[0028]结果如下:
[0029]1.前列腺癌细胞中HOTAIR表达上调
[0030]如图-1A所示，2株前列腺癌细胞株(PC3、DU145)与人正常前列腺上皮细胞(RffPE-1)相比，HOTAIR表达相对上调。PC3上调约3.2倍，DU145上调约5.4倍(*，Ρ〈0.05 ；**，Ρ〈0.01)。s1-HOTAIR 干扰后，HOTAIR 表达水平下调约至 40%。见图-1B。(**，Ρ〈0.01)
[0031]2.HOTAIR对前列腺癌细胞周期的影响
[0032]流式细胞术结果(图-2)显示，在s1-HOTAIR下调HOTAIR的表达水平后，2株前列腺癌细胞都出现了 G2期阻滞，同时伴有Gl期的下调。(*，Ρ〈0.05)。
[0033]3.HOTAIR对前列腺癌细胞侵袭能力的影响
[0034]Transwell实验结果(图-3)表明，在s1-HOTAIR下调HOTAIR的表达水平后，前列腺癌细胞株的侵袭能力受到了明显的抑制。(林，ρ〈0.01)
[0035]上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种抑制长链非编码RNA-HOTAIR表达的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用，所述的靶向抑制HOTAIR的小RNA的核苷酸序列为如下的任意一种:s1-HOTAIRl: 5’ -UUUUCUACCAGGUCGGUAC-3’，如 SEQ ID N0.1 所示；s1-H0TAIR2: 5’ -AAUUCUUAAAUUGGGCUGG-3’，如 SEQ ID N0.2 所示。2.根据权利要求1所述的一种靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用，其特征在于所述的药物还可包括制剂允许的赋形剂。
【专利摘要】本发明公开靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用。编码HOTAIR基因的DNA序列位于12号染色体的HOXC11基因与HOXC12基因之间。HOTAIR是长度为2158nt、迭接的多聚核苷酸转录产物。编码HOTAIR的序列中包括5个短外显子和1个长外显子。本发明包含多种序列的siRNA，这些小RNA能通过靶向下调前列腺癌细胞中HOTAIR基因的表达，诱导细胞周期阻滞，抑制细胞侵袭迁移能力，进而可以应用于前列腺癌药物的制备。本发明siRNA制备简单，成本低，用量少，50nM的转染浓度即可达到良好的抑制效果，抑制作用确切；且siRNA抑制基因表达不会破坏基因组的完整性。
【IPC分类】A61K48/00, A61P35/00, A61K31/7088
【公开号】CN104971363
【申请号】CN201510264863
【发明人】金晓东, 朱意, 虞日考, 纪阿林, 姚晓霖, 方家杰
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年5月22日