猪圆环病毒双亚型orf2共表达载体构建及疫苗制备
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪圆环病毒双亚型0RF2共表达载体的构建及亚单位疫苗的制备。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV)是最小的动物病毒之一，病毒粒子直径 17-20nm，属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，单股、环状、闭合的DNA病毒。根据致病性、 抗原性和核酸序列的差异，PCV可分为PCVl和PCV2。PCVl为猪肾细胞系的一种污染物，对 猪无致病性，而PCV2具有致病性，PCV2及其与其他病原体混合感染对养猪业带来重大经 济损失。在猪圆环病毒病（Postwearing multisystemic wasting syndrome associated disease, PCVAD)中，断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)和猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease comples，PRDC) 是最常见的临床表现形式。PCV2感染使机体在感染期间发生免疫抑制，可造成猪的淋巴细 胞缺失，不能通过有效的免疫应答清除病毒。在患病最后阶段，PMWS病猪表现为严重的淋 巴组织损伤，同时影响外周血单核细胞和淋巴组织器官中细胞因子的表达。
[0003] PCV2分为PCV2a，PCV2b和PCV2c三个基因亚型。PCV2主要有两个开放阅读框ORFl 和0RF2。ORFl位于病毒基因组上，编码两种复制酶（Replicase，Rep和R印'）；0RF2位于 病毒基因组的链上，编码病毒粒子的Cap蛋白。该蛋白是PCV2唯一的结构蛋白，也是PCV2 主要的免疫原性蛋白。PCV20RF2的大部分基因是抗原表位的所在区域。
[0004] 2003年前PCV2流行毒株以PCV2a亚型毒株为主，其后至今PCV2流行毒株则以 PCV2b亚型为主。临床PMWS发生率与PCV2a向PCV2b基因型的改变有密切相关。如2004 年加拿大魁北克州的猪场鉴定出新的基因型PCV2b，猪群中PCVAD的死亡率有所增加。韩国 在2000~2008年期间鉴定出的PCV2毒株大部分为PCV2b。
[0005] 为防控PCV2对养猪业造成的影响，研发了多种PCV2商品化疫苗。疫苗的应用有 效控制了 PCV2的流行。PCV2疫苗自从2006年商品化以来，该疫苗已成为防控PCVAD最重 要的手段。目前为止，全球已成功注册的PCV2疫苗分为2类：全病毒灭活疫苗和单亚型亚 单位疫苗。其中进口注册的商品化疫苗全部来源于PCV2a基因型毒株，国内近几年陆续有 PCV2b亚型的灭活疫苗与亚单位疫苗上市，如申请人的猪圆环病毒2型灭活疫苗（ZJ/C)株， 武汉中博生物股份有限公司的猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（CP08株）等。尽 管已有上述国内外多个不同种类、不同亚型的疫苗上市，但圆环病毒的防控效果并不理想， 仍然是困扰养殖业的一个重大疫病。如前所述，PCV2a疫苗株、PCV2b疫苗株虽然能够相互 提供一定的交叉保护，但由于PCV2a与PCV2b毒株之间的抗原性存在差异，保护力无法达到 100%，这可能是造成疫病防控效果不佳的主要原因之一。
[0006] 因此，本领域仍然需要能够为PCV的防控提供更有效、更全面的防护，同时一针双 防，在提供全面保护效果的同时，还可减少免疫次数，节约免疫成本的疫苗。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物含有PCV2a 0RF2编码的Cap 蛋白和PCV2b 0RF2编码的Cap蛋白。
[0008] 在一个具体实施例中，所述PCV2a 0RF2编码的Cap蛋白如SEQ ID NO: 2所示。
[0009] 在一个具体实施例中，所述PCV2b 0RF2编码的Cap蛋白如SEQ ID NO: 4所示。
[0010] 在一个具体实施例中，所述免疫原性组合物还含有佐剂。
[0011] 在一个具体实施例中，所述佐剂选自：NeB复合缓释水性佐剂。
[0012] 在一个具体实施例中，所述佐剂含有MONTANIDE ISA 28VG水性佐剂和 Carbopol971P〇
[0013] 在一个具体实施例中，所述免疫原性组合物中每毫升免疫组合物含1 μ g-100 μ g， 优选每毫升5 μ g_50 μ g，最优选每毫升20 μ g的Carbopol971P。
[0014] 本发明还提供一种构建猪圆环病毒双亚型0RF2共表达载体，该表达载体使用 PFastBac-Dual载体作为骨架，在该载体的Pplt^动子下游插入PCV2a的0RF2,在该载体的 Pph启动子下游插入PCV2b的0RF2。
[0015] 在一个具体实施例中，在该载体的Pplt^动子下游插入PCV2b的0RF2,在该载体的 Pph启动子下游插入PCV2a的0RF2。
[0016] 在一个具体实施例中，所述PCV2a的0RF2如SEQ ID NO: 1所示。
[0017] 在一个具体实施例中，所述的PCV2b的0RF2如SEQ ID NO:3所示。
[0018] 在一个具体实施例中，所述共表达载体是重组转移质粒。
[0019] 本发明还提供一种重组穿梭质粒，该重组穿梭质粒以杆状病毒骨架载体Bacmid 为骨架，并含有PCV2a 0RF2和PCV2b 0RF2。
[0020] 在一个具体实施例中，所述PCV2a的0RF2如SEQ ID NO: 1所示。
[0021] 在一个具体实施例中，所述的PCV2b的0RF2如SEQ ID N0:3所示。
[0022] 在一个具体实施例中，所述重组穿梭质粒经由所述共表达载体与杆状病毒骨架载 体Bacmid在宿主细胞中发生同源重组而制备得到。
[0023] 在一个具体实施例中，所述宿主为大肠杆菌。
[0024] 本发明还提供一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒含有PCV2a 0RF2和PCV2b 0RF2〇
[0025] 在一个具体实施例中，所述PCV2a的0RF2如SEQ ID NO: 1所示。
[0026] 在一个具体实施例中，所述的PCV2b的0RF2如SEQ ID NO:3所示。
[0027] 在一个具体实施例中，通过用所述重组穿梭质粒转染昆虫细胞而制备得到所述重 组杆状病毒。
[0028] 本发明还提供一种免疫原性组合物的制备方法，该方法包括：
[0029] (1)提供猪圆环病毒双亚型0RF2共表达载体；
[0030] (2)由（1)所述的猪圆环病毒双亚型0RF2共表达载体制备重组穿梭质粒；
[0031] (3)将步骤（2)所述重组穿梭质粒转染昆虫细胞，制备得到重组杆状病毒；
[0032] (4)将步骤（3)所获得的重组杆状病毒接触昆虫细胞，获得重组蛋白PCV2a Cap和 PCV2b Cap ；
[0033] (5)将步骤（4)所获得的重组蛋白加到佐剂中，从而制备得到所述免疫原性组合 物。
[0034] 在一个具体实施例中，所述步骤（1)中的猪圆环病毒双亚型0RF2共表达载体使用 PFastBac-Dual载体作为骨架，在该载体的Pplt^动子下游插入PCV2a的0RF2,在该载体的 Pph启动子下游插入PCV2b的0RF2。
[0035] 在一个具体实施例中，所述步骤（1)中的猪圆环病毒双亚型0RF2共表达载体使用 PFastBac-Dual载体作为骨架，在该载体的Pplt^动子下游插入PCV2b的0RF2,在该载体的 Pph启动子下游插入PCV2a的0RF2。
[0036] 在一个具体实施例中，步骤（2)中的重组穿梭质粒以杆状病毒骨架载体Bacmid为 骨架，并含有 PCV2a 0RF2 和 PCV2b 0RF2。
[0037] 在一个具体实施例中，所述佐剂为NeB复合缓释水性佐剂。
[0038] 本发明还提供所述免疫原性组合物在制备能减轻PCV2感染相关性临床症状的严 重性的药物中的应用。优选地，所述药物用于预防PCV2感染，尤其是PCV2a和PCV2b单独 或混合感染，更优选用于小猪。
[0039] 本发明还包括所述免疫原性组合物在制备用于（i)预防PCV2再次感染或（ii)减 少或消除PCV2所致对象临床症状的药物中的应用。
【附图说明】
[0040] 图1显不pFastBac-Dual载体图谱。
[0041] 图2显示PCV2-0FR2进化树分析。
[0042] 图3显示重组转移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b_Cap的PCR鉴定。其中，M为 DNA marker DL2000 ;1 为重组转移质粒 pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap 以 PCV2a-Cap 引 物进行PCR扩增的产物；2为重组转移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap以PCV2b-Cap 引物进行PCR扩增的产物。
[0043] 图4显示重组转移质粒pFastBac/PCV2a-PCV2b_Cap的酶切鉴定。其中，Ml为 DNA marker DL2000 ;M2 为 DNA marker DL15000 ;1 和 2 分别为重组转移质粒 p