一种负载表阿霉素的石墨烯量子点载药体系及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种负载表阿霉素的石墨烯量子点载药 体系，以及该体系在抗宫颈癌药物方面的应用。
【背景技术】
[0002] 目前肿瘤临床应用的主要问题是肿瘤的诊断与治疗分离，在治疗的同时不能充分 反映肿瘤患者临床的动态过程，不能完全预测肿瘤的治疗效果。传统的化疗药物不能有效 区别肿瘤细胞和正常细胞，导致了毒性和不良反应，而且容易产生耐药性。使用载药体系， 可尽可能降低药物的毒副作用，但需要光学特性监测药物的体内分布及肿瘤的治疗进展。 因此，集化疗、示踪显像为一体的载药体系的设计和应用有望解决这个难题。
[0003] 石墨烯是近年来新发现的碳基纳米材料之一，因其具有巨大的二维平面结构、大 的比表面积、良好的生物相容性、长的体内循环时间、纳米尺寸的结构特点，使其在药物载 体方面拥有巨大的应用空间。但石墨烯片层间较强的范德华力及其疏水的特性，在生理条 件下容易团聚而丧失应用价值。因此，石墨烯应用于载药体系必须具备下列条件：①必须进 行必要的功能化修饰，使其具有良好的水溶性及生物相容性；②作为药物载体的石墨烯尺 寸必须合理，有利于石墨烯与细胞之间的物质交换；③石墨烯的用量在保证载药量的前提 下应尽可能少，尽管修饰后的石墨烯对生物体没有明显毒性，但由于其结构稳定不易分解， 容易在某些组织中长时间沉积。然而，关于小尺度石墨烯-通常称为石墨烯量子点（GQDs) 作为药物载体的研宄还非常有限。
[0004] 石墨烯量子点具有光致发光性能，可以作为一种新型荧光二维碳纳米材料，有望 构建具有载药、示踪显像等多功能的纳米载药平台。目前合成GQDs的方法主要有水热 法、二次氧化法、强酸氧化法、微波分解法、电化学法和有机合成法等。当前对石墨烯量子 点的研宄主要集中于合成、表征、荧光发光研宄及生物标记应用。2006年，孙亚平等（Sun YP, Zhou B, Lin Y，et al, J Am Chem Soc 2006,128(24):7756)通过强酸回流得到的发光 效率高达20%的石墨烯量子点，没有明显体外/体内毒性，且荧光成像效果接近于传统的 CdSe/ZnS 量子点。Tao 等人（Tao H，Yang K，Ma Z，et al，Small，2012,8(2):281)也通过小 鼠实验发现石墨烯量子点在体内代谢快、毒性小、有望应用于体内成像。Wclav等（Stengl V，Bakardjieva S, Henych J, et al.，Carbon, 2013, 63:537)提出了一种一步合成、可放大 生产、低成本的方法，即在有机溶剂中对氧化石墨烯进行回流，得到了强绿色和蓝色荧光的 石墨稀量子点。Wang 等（Wang Z H, Zhou C F, Xia J F，et al·，Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2013, 112:192)合成了强绿色的荧光石墨烯量子点，通过PEG修饰后的 GQDs-PEG可以作一种具有示踪效果的优异的药物载体。
[0005] 表阿霉素（EPI)作为一种抗生素类抗肿瘤药物，用于治疗宫颈癌已取得了较好的 效果。但是表阿霉素对宫颈癌细胞的选择性较低，毒性较大，所以为了提高药物负载率、降 低细胞毒性、提高生物相容性，使用药物载体对表阿霉素进行负载，控制其释放具有十分重 要的意义。
[0006] 目前，关于石墨烯量子点载药的研宄较少，因此，开发一种工艺简单、负载率高、低 毒、生物相容性好、荧光成像的石墨烯量子点载药体系，并开展其对宫颈癌Hela细胞的毒 性研宄，对推广纳米药物载体在宫颈癌治疗中的应用具有重要意义。
[0007] 申请号为201310352511. 5、公开号为103432590A的发明专利申请《石墨烯量子点 核靶向载药体系及其制备方法和应用》，提供了一种利用HUMMER法合成的氧化石墨烯水溶 液为起点物制备石墨烯量子点体系。与该专利申请通过π - π物理作用实现对表阿霉素 的负载不同：一方面，本发明采用水热法合成的氨基化的绿色石墨烯量子点在物理包埋表 阿霉素时，可通过π - π物理作用实现对表阿霉素的负载；另一方面，本发明表阿霉素可 通过其结构中的-COOH基团与氨基化石墨烯量子点上的_順 2进行酰胺化反应，从而使表阿 霉素通过化学偶联的方式与量子点载体共价连接，达到双重载药的效果。
[0008] 本发明采用绿色石墨烯量子点作为药物载体、负载抗肿瘤药物表阿霉素形成表阿 霉素石墨烯量子点载药体系并对宫颈癌Hela细胞毒性分析，未见相关研宄报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种能高效负载抗肿瘤药物表阿霉素的石墨烯量子点体系 的制备方法。
[0010] 为实现本发明的目的，本发明的技术方案包括以下步骤：
[0011] 步骤1 :水热法制备石墨烯量子点；
[0012] 利用有机化合物芘在热浓硝酸条件下的硝化作用，稀释过滤除酸后，得到黄色的 1，3, 6-三硝基花（1，3, 6-trinitropyrene);利用配制的NaOH溶液或者水合肼和氨水修饰 改性；通过超声处理和高压反应釜加热合成水溶性石墨量子点产物GQDs ;最后过滤，在真 空条件下加热干燥，得到纯化的绿色石墨烯量子点GQDs ;
[0013] 步骤2 :将表阿霉素和石墨烯量子点水溶液添加到pH = 7. 4的PBS磷酸缓冲溶液 中，将混合液超声分散，混合均匀，在黑暗中不断搅拌，振荡12~24h，获得载有表阿霉素的 石墨烯量子点溶液；将此溶液离心，取沉淀物进行真空干燥，干燥后得到石墨烯量子点载药 体系，备用；其中：表阿霉素在PBS磷酸缓冲溶液中的质量体积比为ImgdOml ;石墨烯量子 点在PBS磷酸缓冲溶液中的质量体积比为Img :10ml ;所得到的石墨稀量子点载药体系中， 表阿霉素：石墨稀量子点质量比1:0. 5~1:2 ;
[0014] 步骤3 :将石墨烯量子点载药体系进行药物缓释实验；
[0015] 称取石墨烯量子点载药体系放入适量去离子水中，平均分成两等分，将两份混合 液分别置于PH = 5. 5和pH = 7. 4的磷酸缓冲溶液中，进行缓释实验；将溶液放在全温度振 荡培养箱中，每隔一定时间用移液枪量取样品测定药物释放量，并且补加磷酸缓冲溶液； 表阿霉素的浓度为〇. 005~0. 02mg/ml，载药体系的浓度为0. 2~lmg/ml ;
[0016] 步骤4 :将石墨烯量子点载药体系与宫颈癌Hela细胞共培育，用MTT法检测石墨 烯量子点载药体系细胞毒性；
[0017] 在装有石墨烯量子点载药体系的EP管中，加入75%乙醇消毒，备用；将对数期生 长的Hela细胞接种于96孔板，利用DMEM高糖完全培养基进行培养；培养24h后，分别加入 不同浓度的石墨烯量子点载药体系；同时设置只加入DMEM高糖完全培养基作为对照组，未 接种细胞作为空白组，每组设置6个复孔，分别继续培养24h，每孔加入MTT溶液，培养箱内 继续培养4h后，弃去孔内的培养基，然后每孔加入二甲基亚砜（DMSO)，置摇床避光低速振 荡，使结晶物充分溶解；利用酶标仪在490nm波长下测定吸光值（OD)。
[0018] 步骤2中，表阿霉素和石墨烯量子点的质量比优选为1 :1。
[0019] 本发明还提供了 一种按照上述步骤所得到的产品。
[0020] 本发明的绿色石墨烯量子点采用水热法合成，参见文献:Wang L, Wang YL, Xu T, et al, Nature communications, 2014, 5:5357,依照现有技术制备纯化的绿色石墨稀量子点 GQDs0
[0021] 本发明中的蓝色石墨烯量子点由南京先锋纳米科技有限公司提供，采用有机合成 法制备，带有氨基官能团，粒径约2~5nm。
[0022] 本发明的表阿霉素石墨烯量子点载药体系，分别在pH = 5. 5和pH = 7. 4的PBS 磷酸缓冲溶液的环境下制备。
[0023] 将 2 ~4mg EPI 和 2 ~4ml GQDs (mg/mL)分别添加到 pH = 5. 5 和 pH = 7. 4 的 PBS磷酸缓冲溶液（20~40ml)中，将混合液超声分散，混合均匀，在黑暗中不断搅拌，振荡 12~24h，获得载有表阿霉素的石墨烯量子点溶液。将此溶液离心，取沉淀物进行真空干 燥，干燥后得到的产物即为石墨烯量子点载药体系（EPIOGQDs)。本发明所得的载药体系为 表阿霉素和石墨烯量子点的复合物。
[0024] 本发明对石墨烯量子点载药体系进行了药物缓释实验。
[0025] 称取石墨烯量子点载药体系放入适量去离子水中，平均分成两等分，将两份混合 液分别置于PH = 5. 5和pH = 7. 4的磷酸缓冲溶液中，进行缓释实验。将溶液放在全温度振 荡培养箱中，每隔一定时间用移液枪量取样