不含明胶的疫苗保护剂组合物及流感减毒活疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗生产工艺技术领域，具体地，本发明涉及一种不含明胶的液体疫 苗保护剂组合物，以及包含所述液体疫苗保护剂组合物的流感减毒活疫苗。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒是由流感病毒引起的一种严重危害人类健康的急性呼吸道感染疾病。 流感病毒分为甲（A)、乙（B)、丙（C)三个型别，其中甲型流感病毒的抗原性经常出现变异， 在历史上曾多次引起世界性大流行。甲型流感也在猪和禽类中传播，并引起流感流行，造成 大量动物死亡。而人乙、丙型流感仅在人之间转播。乙型流感病毒对人类致病性较低。丙 型流感病毒主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。据WHO估计，在爆发性流行时，流感病 毒可在全世界迅速传播，影响总人口的10%~20%。即使在非爆发性流行的年份，流感每 年也造成300万~500万例严重病例和25万~50万例死亡。
[0003] 迄今为止，接种流感疫苗是防治流感的最有效的手段。疫苗接种不仅可以降低高 危人群的发病率和死亡率，也可减轻症状，降低并发症的发生、降低继续传播的机率。
[0004] 流感减毒活疫苗采用鼻粘膜途径进行免疫，具有模拟天然感染的优点。与灭活疫 苗相比，流感减毒活疫苗除了能诱导体液免疫外，还能诱导产生局部中和抗体以及细胞免 疫应答，并且免疫应答持续时间持久。另外流感减毒活疫苗使用方便，易于进行大规模免 疫。
[0005] 流感减毒活疫苗一般为冻干粉针剂型。虽然冷冻干燥技术已经成熟，但还存在一 些缺点：首先，冻干粉针剂在使用过程中需要复溶，不便于使用并且增加了污染的机会；其 次，生物制品的冷冻干燥工艺复杂、工艺过程耗时长、流感病毒滴度损失较大；第三，真空冷 冻干燥设备投资大、能耗高、生产成本高，疫苗生产能力有限，尤其是在流感大爆发时，疫苗 生产厂商很难在短时间内生产出足够剂量的疫苗。
[0006] 2003年，MedImmune公司的流感减毒活疫苗FluMist获得了 FDA的批准。该产品 是一种冷适应三价病毒疫苗，为水针剂型。该产品需要在约15°C及以下储藏、运输，但由于 药房或学校通常都没有处理冷冻产品的设备，使得FluMist不能大范围使用。
[0007] 2005年，MedImmune公司提交了名为"冷藏温度稳定的流感疫苗组合物"的专利 (专利申请号PCT/US2005/035614)，提供了一个可使流感疫苗在4~8°C保持稳定的、含有 水解明胶组分的液体制剂组合物。然而，该组合物中的明胶或明胶衍生物可直接引起使被 接种者过敏的变态反应和非细胞介导免疫反应。
[0008] 因此，为克服冷冻干燥技术成本高和水解明胶组分易引起变态反应和免疫反应的 缺点，需要开发出不含明胶的疫苗液体制剂保护剂以及包含其的流感减毒活疫苗。
【发明内容】
[0009] 发明人经过研宄，发明了一种用作流感减毒活疫苗保护剂的组合物，该组合物中 不含明胶成分，对人体的刺激性小，并且用该组合物制备的流感减毒活疫苗在冷藏条件下 可保持较好的稳定性和较长有效期。
[0010] 因此，本发明提供一种用作流感减毒活疫苗保护剂的组合物，其中包含的组分及 其浓度为：人血清白蛋白I. 0~15. Og/L，优选1. 5~12. Og/L，更优选2. 5~10.0 g/L ;蔗糖 15. 0 ~95. Og/L，优选 40. 0 ~85. Og/L，更优选 50. 0 ~75. Og/L ;谷氨酸钠 0· 5 ~15. Og/ L，优选0. 5~12. 0g/L，更优选0. 5~10. 0g/L ;其中，所述组合物的pH为5. 0~9. 0,优选 为pH 5. 5~8. 5,更优选为pH 6. 0~8. 0,最优选为pH 6. 0~7. 4。
[0011] 本发明的组合物中还包括尿素，其浓度为〇~8. 0g/L，优选0. 5~6. 0g/L，更优选 1. 0~4. 0g/L ;精氨酸，其浓度为0~10. 0g/L，优选1. 0~10. 0g/L，更优选1. 4~10.0 g/ L ;组氨酸，其浓度为0~2. 0g/L，优选为0. 5~I. 5g/L ;山梨醇，其浓度为0~70. 0g/L，优 选15. 0~60. 0g/L，更优选25. 0~50. 0g/L ;甘氨酸，其浓度为0~20. 0g/L，优选3. 0~ 15. 0g/L ;甘露醇，其浓度为0~30. 0g/L，优选10. 0~20. 0g/L。
[0012] 此外，本发明还提供了本发明的组合物用于提高疫苗稳定性和安全性的用途以及 用于制备流感减毒活疫苗的用途。
[0013] 此外，本发明还提供一种流感减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，使用本发明的 组合物作为保护剂。
【具体实施方式】
[0014] 因此，本发明提供一种用作流感减毒活疫苗保护剂的组合物，其中包含的组分及 其浓度为：人血清白蛋白1. 〇~15. 0g/L，优选1. 5~12. 0g/L，更优选2. 5~10. 0g/L ;蔗糖 15. 0 ~95. 0g/L，优选 40. 0 ~85. 0g/L，更优选 50. 0 ~75. 0g/L ;谷氨酸钠 0· 5 ~15. Og/ L，优选0. 5~12. 0g/L，更优选0. 5~10. 0g/L ;其中所述组合物的pH为5. 0~9. 0,优选 为pH 5. 5~8. 5,更优选为pH 6. 0~8. 0,最优选为pH 6. 0~7. 4。
[0015] 本发明的组合物中还包括尿素，其浓度为0~8. 0g/L，优选0. 5~6. 0g/L，更优选 1. 0~4. 0g/L ;精氨酸，其浓度为0~10. 0g/L，优选1. 0~10. 0g/L，更优选1. 4~10.0 g/ L ;组氨酸，其浓度为0~2. 0g/L，优选为0. 5~I. 5g/L ;山梨醇，其浓度为0~70. 0g/L，优 选15. 0~60. 0g/L，更优选25. 0~50. 0g/L ;甘氨酸，其浓度为0~20. 0g/L，优选3. 0~ 15. 0g/L ;甘露醇，其浓度为0~30. 0g/L，优选10. 0~20. 0g/L。
[0016] 本发明还提供了本发明的组合物用于制备流感减毒活疫苗的用途。
[0017] 本发明还提供一种流感减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，使用本发明的组合 物作为保护剂。
[0018] 在一个优选实施方案中，本发明的流感减毒活疫苗的制备方法包括以下步骤：将 本发明的组合物的各个组分依次溶于pH缓冲液中；将pH调节到指定值；过滤除菌；加入病 毒原液，即得流感减毒活疫苗。
[0019] 在一个优选实施方案中，根据本发明的方法制备的液体流感减毒活疫苗的pH为 5. 0~9. 0,优选为pH 5. 5~8. 5,更优选为pH 6. 0~8. 0,最优选为pH 6. 0~7. 4。
[0020] 在一个优选实施方案中，使用磷酸盐缓冲液作为pH缓冲液。
[0021] 本发明还提供一种使用本发明的组合物和/或根据本发明的方法制备的流感减 毒活疫苗。
[0022] 在一个优选实施方案中，本发明的流感减毒活疫苗为注射剂或鼻喷雾剂。
[0023] 以下通过实施例对本发明进行进一步说明。
[0024] 实施例1 :
[0025] I. pH 的测定
[0026] pH的测定根据《中华人民共和国药典（2010年版）》（三部）附录V A进行。
[0027] 2.病毒滴度的测定
[0028] 细胞系：
[0029] MDCK细胞：犬肾上皮传代细胞系（Madin~Daby canine kidney cells)，购自 ATCCo
[0030] 病毒毒株：
[0031] HlNl 型流感病毒毒株：A/17/California/2009/38 (HlNl)，由 WHO 提供；
[0032] H3N2 型流感病毒毒株：A/17/Perth/09/87 (H3N2)，由 WHO 提供；
[0033] B型流感病毒毒株：B/56/Brisbane/60/08,由WHO提供。试剂：
[0034] TPCK-Trypsin (购自 Sigma，货号：T1426)溶液；
[0035] DMEM细胞培养液（购自Sigma，货号：D6546);
[0036] 胎牛血清（购自 Hyclone，货号：SH3OO7O. 〇3);
[0037] L-谷氨酰胺（购自Gibco，货号：25030)溶液；
[0038] 青链霉素（购自Gibco,货号：15140);
[0039] HEPES (购自吉诺生物，货号：GNM11344)溶液；
[0040] 一抗：Anti-Influenza A Virus Nucleoprotein antibody，购自 Abeam，货号： [AA5H]ab20343 ；
[0041] Anti-Influenza B Virus Nucleoprotein antibody，购自 Abeam，货号：[B017] ab20711 ；
[0042] 二抗：Alexa Fluor? 488Goat Anti-Mouse IgG(H+L)Antibody，购自 Lifetechnologies，货号：A-IlOOl ;
[0043] 标准抗体：
[0044] 抗 Al 标准抗体：Influenza Anti-A/California/7/2009 (HlNl)-HA serum，购自 NIBSC，货号：12/108 ;
[0045] 抗 A3 标准抗体：Influenza Anti-A/Perth/l6/2〇〇9_Like HA Serum，购自 NIBSC， 货号：11/206 ;
[0046] 抗 B 标准抗体：Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008HA serum，购自 NIBSC，货 号：11/136。
[0047] 方法：
[0048] (1)样品处理
[0049] 取供试品3瓶混合在一起，作为待检样品。
[0050] 将灭活后的标准抗体分为3组，分别为：
[0051] Gl :抗A3标准抗体1份+抗B标准抗体1份+PBS 3