肽在视网膜神经退行性疾病，特别是在糖尿病视网膜病变早期和神经退行性变起重要作 ...的制作方法
【专利说明】肽在视网膜神经退行性疾病，特别是在糖尿病视网膜病变 早期和神经退行性变起重要作用的其它视网膜疾病的局部 治疗中的应用
[0001] 本发明涉及可能导致部分或全部失明的眼部疾病的医治方法领域。本发明提供可 局部用于眼部的有用工具，包括肽和这些肽的类似物。
[0002] 发明背景
[0003] 视网膜神经退行性疾病指以渐进的神经元丢失为特征的视网膜病况。糖尿病视网 膜病变、老年性黄斑变性、青光眼和色素性视网膜炎被认为是神经退行性变在其中起重要 作用的视网膜疾病。
[0004] 可以从 Schmidt et al.，"Neurodegenerative Diseases of the Retina and Potential for the Protection and Recovery'，，Current NeuropharmacoIory -2008, Vol. No. 6, pp. : 164-178摘选对这些疾病、它们的关键部位的深入分析以及保护的可 能方法和恢复的方法。
[0005] 糖尿病视网膜病变（DR)是糖尿病最常见的并发症，并且在发达国家仍是工作年 龄个体失明的主要原因。现有的DR的治疗如激光光凝术、皮质类固醇或抗-VEGF药剂的玻 璃体内注射的病征在该疾病的太晚期阶段才显示，并与显著的副作用有关。
[0006] 糖尿病视网膜病变（DR)通常被认为是视网膜微循环疾病。然而，有些数据显 示视网膜神经退行性变是DR发病机理中的早期事件，其参与在DR中发生的微循环异 常，这可以从代表"糖尿病视网膜病变早期治疗的欧洲联盟"（EUR0C0ND0R)的Sim0 et al. ''Neurodegeneration is an early event in diabetic retinopathy:therapeutic implications^ , Br. T. Ophthalmol. - 2012, vol. 96, pp. 1285-1290 中推理得出。
[0007] 在DR中，神经退行性变（有效神经元的丢失）发生在疾病的早期阶段，并引起功 能异常如辨色力和对比灵敏度的丧失。这些改变可通过对糖尿病患者的电生理学研究来检 测，即使其患糖尿病的时间少于两年，即在可通过眼科检查检测到微血管损伤之前。此外， 延迟的多焦ERG(视网膜电图）隐式时间（mfERG-IT)预测了早期微血管异常的发生。而且， 神经视网膜退变启动和/或激活了一些代谢和信号转导通路，这些通路将参与微血管病过 程以及血视网膜屏障的破坏（DR发病机理的关键部分）。
[0008] 目前，并未对与发病机理有关的视网膜神经退行性疾病或神经退行性变的早期阶 段进行治疗，尽管其能够防止早期病变，如导致视网膜新血管化的微循环问题。因此在早期 阶段，特别是DR，没有进行治疗，而是进行患者的标准随访。
[0009] 另一方面，当把这些视网膜神经退行性疾病（特别是DR)的早期阶段作为治疗 目标时，建议积极的治疗（例如激光光凝术或玻璃体内注射）将是不可想象的。迄今为 止，不认为滴眼液的使用是施用药物以预防或阻止DR的好途径。这是因为如Urtti A et al. , "Challenges and obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery'，· Adv. Drug. Deliv. Rev. 2006, vol. 58, pp. 1131-1135 中声明的：通常认为它们不能到达 眼后段（即玻璃体和视网膜）。尽管存在少量证据证明，在角膜中施用的组合物能够到 达视网膜，但是它们代表的是孤立事件，并且对应于低分子量的组合物，如Aiello et al.，"Targeting Intraocular Neovascularization and Edema - One Drop at a Time'，, N. Eng. T Med - 2008, vol. 359, dp. 967-969 中提到的那些。Aiello et al.显示，在两个不同的 测试中，一种由吡咯烷衍生来的化合物（名为TG100572,4-氯-3-(5-甲基-3-{[4-(2-吡 咯烷-1-基乙氧基）苯基]氨基}_1，2, 4-苯并三嗪-7-基）苯酚），一旦以滴眼液的形式 施用就能够到达视网膜靶点，该化合物具有作为涉及新血管产生和视网膜水肿的激酶的抑 制剂而发挥作用的能力。尽管如此，这一小分子化合物不能与其它天然存在的化合物进行 比较，如具有高分子量的肽或蛋白。
[0010] 糖尿病是具有高血糖症特征的一组慢性疾病。为了预防糖尿病并发症，使用血糖 降低剂降低高血糖是必不可少的。因此，任何葡萄糖降低药物对预防或阻止糖尿病并发 症（包括DR)都可能在理论上是有益的。然而，缺少关于抗糖尿病剂不依赖于其对血糖 水平的降低作用而对DR有直接效果的信息。通过举例说明的方式，使用被称为艾塞那肽 (Byeta, Amylin Pharmaceuticals)和利拉鲁肽（Victoza, Novo Nordisk)的膜高血糖素样 肽-1激动剂，通过促进血糖水平的降低来治疗2-型糖尿病。此外，已知这些激动剂引起代 谢综合症相关疾病如肥胖和高血压的改善。专利申请文件W02007062434也公开了一种鼻 内施用的药物组合物，其中递送同样的胰高血糖素样肽-I (GLP-I)来治疗代谢综合症和糖 尿病并发症，包括DR。
[0011] 根据以上所述，由于疾病的主要原因或起因，特别是血液中高水平的葡萄糖，在最 终的实例中得到了改善，因而已知施用此种胰高血糖素样肽-1激动剂也可改善或减轻DR 症状。尽管如此，这些治疗并未消除系统性副作用。此外，如果这些物质必须以治疗有效浓 度到达视网膜就需要高剂量，因而增强了副作用。
[0012] 在 Zhang et al. , ''Intravitreal injection of exendin-4 analogue protects retinal cells in early diabetic rats"，Invest Ophthalmol Vis Sci.-2011. vol. 52 (I)，pp. 278-85中公开的一项研究显示，在体内模型中由GLP-IR激活介 导了神经保护。作者报道，在患有链脲霉素（STZ)引起的糖尿病的大鼠中，玻璃体内施用毒 蜥外泌肽-4 (艾塞那肽）预防了与神经退行性变有关的视网膜电图（ERG)异常和形态学特 征。然而，不能轻易地将Zhang et al.研究中的结果推测到人DR(或具有视网膜神经退行 性变的其它疾病）。首先，由于在STZ-DM模型中，对结果的解释可能受STZ神经毒性作用的 影响。第二，尽管在大鼠视网膜中发现了 GLP-IR的表达，但是这在人视网膜中还未有在先 报道。最后，如上文提到的，对在眼底检查中仅有极少（如果有）微血管异常的患者实施玻 璃体内注射是不合适且有侵袭性的。
[0013] 目前，对于视网膜神经退行性疾病没有特定的治疗方法。具体以DR为例，这意味 着对于背景性视网膜病变或非增殖性DR，没有特定的治疗方法，也没有保护神经视网膜免 受损伤（导致神经元丢失）的具体方法。因此，当神经退行性变看上去要开始时，需要新的 药物治疗方法用于该疾病早期阶段。在减缓向需要积极治疗（如外科手术）晚期阶段的发 展中，DR的早期治疗将是有效的。
[0014] 发明概述
[0015] 发明人发现了一些肽（所有这些肽均在N-端区域具有相同的特定序列）以及包 含所述肽的组合物，尽管它们分子量很高，但当在眼部局部施用时（即在角膜或结膜穹窿） 它们能够到达视网膜，并且也能保护和预防视网膜退变。这些化合物作为视网膜（特别是 神经视网膜，它是视网膜的一部分，包括神经元但不包括视网膜的色素上皮）的局部神经 保护剂起作用。
[0016] 应当强调局部施用根据本发明的应用的肽，不仅到达了视网膜，也达到了阻止糖 尿病视网膜病变发展的有效浓度。
[0017] 因此，在第一方面，本发明涉及序列长度为13-50个氨基酸的肽，其应用于视网膜 神经退行性疾病的局部治疗和/或预防，所述肽的N-端区域主要包含下述序列：
[0018] HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4 (SEQ ID NO: 1)，其中：
[0019] Xaa1是选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；
[0020] Xaa2是选自缬氨酸和亮氨酸的氨基酸；
[0021] Xaa3是选自丝氨酸和赖氨酸的氨基酸；
[0022] Xaa4是选自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；和
[0023] 组氨酸是N末端残基；
[0024] 局部治疗和/或预防是局部眼部治疗和/或预防，由于当局部施用于眼部时所述 肽能够到达视网膜这一事实，因而是在眼部表面（即在角膜或结膜穹窿）。这适用于本发明 公开的任何实施方案和实施方案的组合。
[0025] 发明人惊奇地发现胰高血糖素样肽-1受体（GLP-IRc)存在于人视网膜中，并且与 所有在先假设相反，它们能够证明分子量为3. 35kDa-4. ISkDa的天然存在的肽物质，当局 部施用于眼部（即，在角膜）时，能够到达视网膜。因而，发明人建议局部施用（局部眼部 施用）包含30-40个氨基酸且包含SEQ ID NO :1的肽，该序列被认为负责GLP-IRc的激活， 并且也存在于哺乳动物GLP-I中。
[0026] 鉴于现有技术，分子量大于IkDa的分子一旦被局部施用于角膜表面将能够到达 视网膜，这是出乎意料的。
[0027] GLP-I (胰高血糖素样肽-1)是在应答食物时由胃肠道L细胞分泌的内源性促胰岛 素肽（"肠促胰岛素反应")。GLP-I通过与它的受体（GLP-IRc)彻底反应，对葡萄糖依赖性 胰岛素分泌、胰岛素基因表达、胰岛β细胞再生、胃肠蠕动、能量平衡和食物摄取有强大的 影响。GLP-I受体（GLP-IRc)是肽激素结合类Bl(分泌素样受体）家族的成员，该家族具 有七个跨膜异源三聚体G蛋白偶联受体（GPCRs)。GLP-IRs分布广泛，它们被发现存在于胰 腺、脂肪组织、肌肉、心脏、胃肠道和肝脏中。此外，GLP-IRs被发现遍及中枢神经系统（即， 下丘脑、纹状体、脑干、黑质和室管膜下层），并且也有一些证据证明，在中枢和周围神经系 统中受GLP-I刺激的GLP-IR发挥神经保护作用。
[0028] 人GLP是具有37个氨基酸残基的肽，其来源于在回肠末端L细胞、胰腺和脑中合 成的前胰高血糖素原。人前胰高血糖素原鉴别于UniProt数据库，登录号PO 1275, 2007年2 月6日；第3版。对前胰高血糖素原进行处理以产生GLP-I (7-36)氨基化合物、GLP-I (7-37) 和GLP-2主要发生在L细胞。使用一个简单的系统来描述肽的片段和类似物。因此，例如， Gly8-GLP-I (7-37)代表GLP-I的一个片段（类似物），其通过缺失Nos. 1-6位的氨基酸残 基以及用Gly取代第8位的天然存在的氨基酸残基（Ala)而形式上衍生自GLP-I。类似地， 1^ 834(，-十四烷酰基）-61^-1(7-37)代表61^-1(7-37)，其中在34位的1^ 8残基的￡-氨 基被十四烷酰化。
[0029] 因此，与所有偏见相反，发明人通过将其局部施用或作为局部组合物（即局部眼 用组合物）的组分，提供可以到达视网膜并在此发挥神经保护作用的肽，解决了眼科领域 的长期需要。此外，这些组合物的局部施用将它们的作用局限于眼部，并将相关的系统性副 作用降低至最小。
[0030] 由于该肽的神经保护作用，本发明的这一方面也可表述为肽在制备视网膜神经退 行性疾病的治疗和/或预防（指局部眼部治疗和/或预防），特别是对于视网膜神经退行 性疾病早期阶段视网膜的治疗和/或预防，特别是DR早期阶段的治疗和/或预防的药物中 的应用，其中所述肽序列长度为13-50个氨基酸，并且在其N端区域包括如上所述的主要包 含HXaaiEGTFTSDXaaSXaalaaYSEQ ID N0:1)的氨基酸序列。本发明也涉及视网膜神经退 行性疾病的治疗和/或预防的方法，特别是视网膜神经退行性疾病早期阶段的神经保护， 特别是DR早期阶段的治疗和/或预防的方法，所述方法包括向需要的对象（包括人）施用 (指在眼部局部施