恒河猴免疫抑制模型的建立的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及环磷酰胺在制备恒河猴免疫抑制模型中的应用以及恒河猴免疫 抑制模型及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 动物疾病模型的建立与运用越来越广泛，目前多集中于啮齿类，但它们的生理机 能和人类有很大的差距。利用非人灵长类动物恒河猴建立实验动物疾病模型具有无可比拟 的优势，恒河猴在生化代谢、生殖生理特性及组织结构等方面与人类高度相似，并且与人类 遗传物质上有98%左右的同源性。并且作为生物医学研究模型已有近百年的历史，如建立 帕金森病、结核病、肝移植等疾病模型，数据十分丰富，早已被用作医学和生物学各领域研 究的理想实验动物造模。
[0003] 环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物，具有广谱抗癌作用，是联合 化疗、手术和放疗辅助化疗的常用药物之一，环磷酰胺的毒副作用主要是免疫抑制。机体 注射环磷酰胺后可导致血生化、血常规、淋巴细胞亚群、细胞免疫因子等指标均表现出相 应变化，呈现剂量依赖性变化。有文献表明大剂量的环磷酰胺会致机体肝肾功能损伤， Winkelstein等的文献报道低剂量的环磷酰胺能够增强机体的免疫功能。为有效评价保 健食品在减轻化疗毒副作用中的功能，高亢等研究并报道了采用环磷酰胺建立小鼠免疫抑 制动物模型的方法。研究结果显示，高剂量的环磷酰胺能抑制机的体免疫功能，低剂量的 环磷酰胺能够促进机体的免疫功能，不同的注射方式和灌胃方式对机体免疫功能的作用也 不同，所以环磷酰胺对对机体所引起的双重作用主要取决于其用药的剂量和给药形式的不 同。但目前而言环磷酰胺更多的是作为一种免疫抑制剂，并且已有大量研究表明其能抑制 动物的细胞和体液免疫应答，造成动物的免疫抑制。
[0004]由于啮齿类动物与灵长类动物在生理机能等方面存在很大差异，高亢等建立的小 鼠免疫抑制模型作为人用生物技术新药研发、人类免疫抑制机理研究和病毒感染模型建立 等方面的评价体系，其可靠性存疑。另外，据检索，目前未见利用非人灵长类建立免疫抑制 模型的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是建立恒河猴免疫抑制模型，为生物技术新药研发、免疫抑制机理 研究、病毒感染模型建立等提供理想、可靠的实验动物模型及完善的评价体系。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：环磷酰胺在制备恒河猴免疫抑制模型中 的应用，具体为将剂量为按体重一日15mg-30mg/kg的环磷酰胺施用于恒河猴。其中，环磷 酰胺的优选剂量为按体重一日15mg/kg;施用方式优选静脉注射。
[0007] 本发明还公开了一种制备恒河猴免疫抑制模型的方法，具体为将剂量为按体重 一日15mg-30mg/kg的环磷酰胺施用于恒河猴。其中，环磷酰胺的优选剂量为按体重一日 15mg/kg;施用方式优选静脉注射。
[0008] 本发明还提供了由上述方法制备得到的恒河猴免疫抑制模型。
[0009] 本发明还提供了一种评价潜在的提高机体免疫力的药物或保健品的方法，具体包 括：
[0010] 1)将环磷酰胺施用于恒河猴，施用方法为：隔日一次，连续4-5次，静脉注射给予 环磷酰胺，施用剂量为：按体重15mg-30mg/kg/次。
[0011] 2)将候选物施用于步骤1)所述的恒河猴；
[0012] 3)用恒河猴免疫抑制模型评价潜在的提高机体免疫力的药物或保健品。
[0013] 其中，步骤3)用于评价潜在的提高机体免疫力的药物或保健品的指标主要是通 过血生化、血常规、流式细胞术、淋巴细胞增殖试验、荧光定量PCR技术检测得到的相关指 标。
[0014] 本发明动物模型可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药研发、免疫抑 制机理研究、病毒感染模型建立等领域，为前述应用提供较啮齿类动物模型更为理想、可靠 的实验动物模型及完善的评价体系，具有良好的理论与应用价值。
[0015] 以下通过【具体实施方式】对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领 域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本 发明所附权利要求的范围。
【附图说明】
[0016] 图1.恒河猴淋巴细胞抑制率实验结果（备注：H:高剂量组，M:中剂量组，L:低剂 量组的2号和3号动物，Ll:低剂量组的1号动物；A:给药前与给药后相比差异极显著（P < 0. 01);a:给药前与给药后差异显著（P< 0. 05);B:给药前与停药后相比差异极显著（P < 0. 01);b:给药前与停药后相比差异显著（P< 0. 05))。
[0017]图 2?高剂量组Hl给药前的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+值。
[0018] 图3.高剂量组HI给药后第5天的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+值。
[0019]图 4?低剂量组LI给药前的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+值。
[0020] 图5.低剂量组LI给药后第5天的⑶3+、⑶3+⑶4+、⑶3 +⑶8+值。
[0021] 图 6?低剂量组L2 给药前的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+值。
[0022] 图7.低剂量组L2给药后第5天的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+值。
[0023] 图8.恒河猴IL-2mRNA相对表达量荧光定量PCR实验结果。
[0024] 图9.恒河猴IFN-ymRNA相对表达量荧光定量PCR实验结果。
[0025] 图10.恒河猴TNF-amRNA相对表达量荧光定量PCR实验结果（备注：H:高剂量 组，M:中剂量组，L:低剂量组的2号和3号动物，Ll:低剂量组的1号动物；A:给药前与给 药后相比差异极显著（P<0. 01);a:给药前与给药后差异显著（P<0. 05) ;B:给药前与停 药后相比差异极显著（P< 〇.01) ;b:给药前与停药后相比差异显著（P<0. 05))。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1恒河猴免疫抑制模型的建立
[0027]1材料与方法
[0028]I. 1 材料
[0029] I.I. 1实验动物
[0030] 选取川西亚种健康恒河猴9只，平均体重3. 5±0. 5kg，平均年龄3-4岁，由四川 农业大学实验动物工程技术中心/国家实验用恒河猴种源基地提供。动物生产许可证： SCXK(川）2013-22,动物使用许可证：SYXK(川）2013-105。
[0031] 1.1. 2实验试剂
[0032] 环磷酰胺、刀豆蛋白（ConA)、生理盐水、血生化试剂盒、血常规试剂盒、RPMI-1640 培养基、酒精、噻唑蓝（MTT)、PBS缓冲液、二甲基亚砜（DMSO)、青霉素、链霉素、犊牛血清、 4%台盼蓝、Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC处理水、人体淋巴细胞分离液、SYBR-GreenII荧光 染料、RNA逆转录试剂盒、RNA提取试剂盒。
[0033] I. 1. 3实验仪器
[0034]电子天平、全自动血细胞分析仪（BeckmancoulterLH750)、全自动生化分析 仪（Olympus)、超净工作台、C02细胞培养箱、光学生物显微镜（Olympus)、冷冻高速离心 机、PCR管离心机、酶标仪（Bio-Rad)、脱色震荡床、漩涡震荡仪、数显恒温搅拌循环水箱、 CFX96TouchDe印Well?Real-TimePCRDetectionSystem(美国BIO-RAD公司）、全自动 凝胶图象分析仪器（BM-Rad)、恒压电泳仪（Bio-Rad)、微波炉（格兰仕）、流式细胞仪器（美 国DB公司）、实验室冰箱。
[0035] I. 1. 4实验器具及耗材
[0036] 一次性注射器、4mlEDTA-K2真空抗凝管、100mL玻璃瓶、烧杯、IOy1移液枪， 200y1移液枪，1000y1移液枪、2.OmlEP管（RNasefree)、一次性96孔细胞培养板、流式 检测专用管、200ylPCR管（RNasefree)、10yl枪头、200yl枪头、1000 yl枪头（RNase free);-次性PE手套、一次性帽子口罩、一次性塑料脱水盒、冰盒、0. 2ml八连管等。
[0037] 2?实验方法
[0038] 2. 1实验动物培养与取材
[0039] 选9只体重相当（平均体重3.5±0.5kg)的健康成年（平均年龄3±0.5岁）恒河 猴，随机标记成三组。分别为环磷酰胺30mg/kg的高剂量组（H1，H2，H3)，环磷酰胺15mg/kg 的中剂量组（M1，M2，M3)，环磷酰胺5mg/kg的低剂量组（Ll，L2,L3)。在实验开始前1周单 笼喂养。给药前后每只实验动物分别静脉采集抗凝血5.Oml和全血2. 0ml。每次给药均是 将环磷酰胺溶解在2.OmL的灭菌生理盐水中。给药前采血一次（每次采血均为早上8:00， 采血前一天，晚上8:00后禁止给动物投食和喂水直到第二天采血结束），为正常组，采用实 验动物自身前后对照。隔天给药，即给药后第1天、第3天、第5天、第7天。停药后每隔4 天采血，采血两次，即停药第4天、第8天，观察动物的免疫恢复情况。每天观察动物的临床 表现。
[0040] 2. 2血液学检测
[0041]用4ml的EDTA-K2真空抗凝管采集血常规检测用血500y1，立即在血液自动分析 仪上测定试验所需要的各项指标。使用注射器静