免疫原性裂解物的制备方法、获得的裂解物、负载有该裂解物的树突状细胞以及含有该裂 ...的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种从间皮瘤肿瘤细胞中制备免疫原性裂解物的方法，如此获得的裂 解物，以及负载有所述裂解物的树突状细胞。此外，本发明还提供了一种含有该裂解物或树 突状细胞的药物组合物。而且，本发明还提供了所述裂解物、树突状细胞或药物组合物在预 防或治疗间皮瘤中的应用。
【背景技术】
[0002] 胸膜腔的恶性间皮瘤是一种高致命的肿瘤。从症状发作起，平均存活持续时间为 9-15个月，预后较差。到目前为止，没有标准的根治性治疗（curativetherapy)恶性胸膜 间皮瘤（下称：间皮瘤）的手段。如胸膜切除术和胸膜外全肺切除术的手术方法会导致高 的局部复发率和可疑的生存希望（questionablesurvivalbenefit)。唯一经美国食品和 药物管理局（FDA)核准的治疗为培美曲塞（pemetrexed)(艾宁达Alimta)/顺铂，具有三个 月的平均生存希望。由于目前治疗方式的有限成就，迫切需要新的治疗方案。利用免疫系 统的特异性和效力的可能性成为了癌症免疫治疗中与日倶增的兴趣的基础。一种激活患者 免疫系统的方法是使用树突状细胞来呈现肿瘤相关抗原，从而产生抗肿瘤特异性的应答。 [0003]树突状细胞是位于机体与它所处的环境的战略性位置的高运动性和非常有效的 抗原呈递细胞。在这些位置，它们收集抗原并将抗原输送到二级淋巴器官，在这里，它们指 导和控制自然杀伤细胞，B和T淋巴细胞的活化，并有效地激活它们以对抗抗原[1]。该属 性使得他们成为对癌症的治疗策略中有吸引力的候选者[2-3]。树突状细胞可以在体外大 量的产生，绕过由免疫抑制肿瘤环境引起的抗原呈递缺陷[4-7]，并随后以成熟状态注入以 诱导抗肿瘤应答[8-11]。
[0004] 已发现，基于树突状细胞的免疫疗法在实验动物和人类的某些癌症，比如肾细胞 癌、黑色素瘤、神经胶质瘤和肺癌中能够诱导保护性和抗肿瘤免疫性[12]。这在间皮瘤中也 被证明。特别地发现，基于树突状细胞的免疫疗法在恶性间皮瘤的小鼠模型中的生存率和 肿瘤生长的减慢上具有有益效果[13]。
[0005]基于这些在实验动物中的临床前发现，已启动临床试验来评估，在间皮瘤患者中， 脉冲的树突状细胞诱导肿瘤特异性细胞毒性T细胞应答的安全性和可行性[14]。10例患 者接受化疗（培美曲塞/顺铂），然后进行三次自体肿瘤裂解物负载的单核细胞来源的树突 状细胞的疫苗接种。如较早在小鼠中发现的那样，在接种树突状细胞疫苗之前化疗，以减少 肿瘤负荷，从而潜在地增加接种的功效。从该研究中能够清楚的知道，在间皮瘤患者化疗后 注射自体肿瘤裂解物负载的树突状细胞是安全和耐受性良好的。
[0006] 但是，使用自体肿瘤细胞裂解物负载树突状细胞具有一定的理论和实际的缺点。 与自体的途径相关联的一个关键问题是，来自于胸恶性肿瘤的切除肿瘤材料的肿瘤细胞， 特别是间皮瘤（胸水或活组织检查）的数量是非常有限的。作为一个例子，第一次使用树 突状细胞的基于免疫治疗间皮瘤的人临床试验中，大多数患者被排除参与[14]。在总数为 57位的间皮瘤患者中，只有10例患者能提供足够的肿瘤材料，虽然所有患者在CT/MRI扫描 中有高肿瘤负荷。
[0007] 此外，从患有间皮瘤的患者获得的自体肿瘤材料在肿瘤总数上是非常不同的，并 被其它细胞"污染"。这导致高度可变的肿瘤细胞裂解物，使得标准化非常困难。当这样的 肿瘤材料被负载到自体树突状细胞时，表型和刺激能力的不同结果是可以预见的。此外，为 每个单独的患者制备自体肿瘤材料是费时费力的。此外，还需要对每个病人的裂解物批次 进行质量检测，使得基于自体肿瘤裂解物的树突状细胞的免疫治疗过程是非常昂贵的。
[0008] 与使用自体间皮瘤肿瘤细胞相关联的另一局限是在体外操作肿瘤来源的细胞的 难度。用以优化制备肿瘤细胞衍生物（凋亡或坏死碎片）、增加免疫原性或通过蛋白质分级 富集、以及其他重要的以增加疗效的步骤的不同方法不能直接在肿瘤的自体材料上进行实 施。离体培养自体细胞直到细胞数量足够用以操纵是不合适的，因为即使进行短期培养间 皮瘤细胞，大多数也未能产生细胞系。另一个使用自体肿瘤细胞是不可行的原因是需要相 对长的培养周期，而在此期间，患者的疾病会进一步发展。
[0009] 在现有技术中，已有建议使用凋亡的同种异体间皮瘤肿瘤细胞用于负载自体树突 状细胞。在这方面，参考了Ebstein等人2003年在AmericanJournalofRespirationand CriticalCareMedicine杂志上的文章。在本文中，将来源于一种细胞系的完整凋亡的、同 种异体间皮瘤肿瘤细胞用于体外研究，其中自体树突状细胞负载有所述完整凋亡的肿瘤细 胞。
[0010] 虽然在本研究结果中表明，用过表达凋亡热休克蛋白的间皮瘤细胞培养树突状 细胞以诱导细胞毒性T细胞应答，Ebstein的方法和所使用的细胞在临床上并不可用。 Ebstein使用的细胞来源于一种细胞系，因而呈递给树突状细胞的抗原将是相对有限的，因 此将严重降低其临床用途。这还可以通过以下事实例证：如果肿瘤细胞之前已经进行了热 休克处理，使用的细胞系只表现出积极的结果。更重要的是，Ebstein使用的仅仅是用UV-B 辐射诱导凋亡的完整的肿瘤细胞。因为许多细胞可以在这种UV-B辐射处理下存活，因此它 们不适合给药于患者。在这方面可以参考查ChalmersA.H等人1976年在CancerResearch 和SalucciS?等人2013 年在InternationalJournalofMolecularSciences上的报道。
[0011] 因此，仍然需要提供一种安全可靠的方法用于治疗间皮瘤患者，以及提供用于预 防或治疗间皮瘤的用途的药物和药物组合物。
【发明内容】
[0012] 本发明的第一个方面涉及一种用于制备免疫原性裂解物的方法，该包括以下步 骤：
[0013] i)提供来自至少两种不同细胞系的同种异体间皮瘤肿瘤细胞；
[0014] ii)诱导肿瘤细胞的坏死或凋亡；
[0015] iii)裂解坏死或凋亡的肿瘤细胞，以获得裂解物。
[0016] 在本发明的方法中，来自至少两种不同的细胞系的同种异体间皮瘤肿瘤细胞第一 次被用于制备可用于免疫治疗具有间皮瘤增加风险的人群或患者的裂解物。
[0017] 由于不同的抗原表达发生在患者不同的间皮瘤肿瘤细胞系中，因此，提供给患者 负载有仅来自一种细胞系的树突状细胞是不足够的。相反，重要的是，用充足的肿瘤抗原来 源来负载树突状细胞，以使得细胞毒性T细胞应答被诱导以抵抗种类繁多的间皮瘤肿瘤。
[0018] 本发明中，这通过使用来自于至少两种不同的细胞系的同种异体间皮瘤肿瘤细胞 裂解物负载树突状细胞来实现。通过使用不同的细胞系，因此，在裂解物中呈现出了大量的 抗原，所述裂解物可以用于负载树突状细胞。这样一来，患者的间皮瘤肿瘤通过下调特定抗 原来逃避的机会将减少。
[0019] 此外，使用所述肿瘤细胞的裂解物来负载树突状细胞是本发明的本质。由于使用 了肿瘤细胞的裂解物，可以获得更好的来自不同肿瘤细胞系的不同抗原的混合物。这样，负 载着所述裂解物的树突状细胞可以呈递来自不同肿瘤细胞系的所有抗原。而这通过使用完 整的细胞系（intact)是（同种异体肿瘤细胞）不可能实现的。使用裂解物的另一个优点 是，它更容易大量生产，这更容易处理和包装，并且其质量可以被相对容易的监控。
[0020] 在本发明的上下文中，术语"间皮瘤肿瘤细胞"是指来源于恶性间皮瘤的细胞。
[0021] 在本发明的上下文中，术语"同种异体"具有其正常的科学意义，是指肿瘤细胞来 源的个体与将根据本发明的方法获得的裂解物进行后续给药的个体不同。从同种异体间皮 瘤肿瘤细胞来源的肿瘤细胞裂解物提供了更加标准化和简单的方法，绕过了需要单独制备 自体肿瘤裂解物。它也提供了选择最佳的来源（凋亡或坏死）、剂量和呈递到树突状细胞或 进行增加细胞免疫原性操作的机会。强大和有效的大规模生产过程的利用也要求较少的产 品批次用以质量控制测试，如一致性（identity)、纯度、数量和无菌/安全测试。相比于自 体，同种异体途径的主要优点是，肿瘤细胞可以被优化，大容量存储，和及时制造/质量控 制，由于供给已经存在，因此，不影响患者的直接疾病进展。
[0022] 按照本发明，术语"坏死"具有其正常的科学意义，是指细胞的形态变化。坏死，例 如，特别是以细胞膜的"泄漏"为特征，即，增加的渗透性，导致细胞的内容物外排和扰动细 胞稳态和离子的平衡的物质的涌入，DNA片段化，最终产生来源于瓦解的细胞的粒状结构， 例如细胞碎片。通常，坏死导致蛋白质分泌到周围环境，当在体内发生时，导致促炎反应。
[0023] 测定细胞是否坏死的方法在现有技术中是已知的。本领域技术人员选择哪种方法 并不重要，因为不同的方法是已知的。
[0024] 根据本发明，坏死细胞可以被确定，例如，通过光、荧光或电子显微技术，使用例如 台盼蓝的经典染色，凭借坏死细胞吸收该染料，因此被染成蓝色，或通过包括丧失膜完整 性、细胞器的崩解和/或染色质的絮凝区的形态变化区分坏死细胞。其他方法包括流式细 胞术，例如通过用碘化丙锭染色坏死细胞。
[0025] 根据本发明，术语"凋亡"具有其正常的科学意义，是指程序性细胞死亡。如果细 胞凋亡，细胞中会发生各种变化，如细胞皱缩、核破碎、染色质浓缩、染色体DNA片段化。
[0026] 凋亡细胞可被确定，例如通过流式细胞术，例如使用膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)实现，用荧光：氟化钠红（Flura-red)，奎因-2 (Quin-2)，7-氨基放线菌素 D(7-AAD)，罗丹明123积累的减少，由核酸内切酶：TUNEL-方法（末端核苷酸转移引起的 X-UTP缺口标记）检测的DNA片段化；通过用赫斯特（Hoechst) 33258染料染色利用光学显 微镜；通过免疫印迹（Westernblot)分析，例如通过用特定的抗体标记89kDa产物检测细 胞凋亡蛋白酶3(caspase3)的活性，或者通过用特定的抗体标记检测细胞色素C的流出； 或者利用特定DNA梯度，通过琼脂糖凝胶DNA分析对典型的DNA片段进行检测。
[0027] 根据本发明，术语"裂解"涉及本领域用于打开/破坏细胞的公知的各种方法。原 则上，任何可以实现裂解肿瘤细胞的方法都可以使用。适当的方法可以由本领域技术人员 在现有技术中选择。例如，可以通过酶促、化学或物理的方法打开/破坏细胞。可用于裂解 肿瘤细胞的酶和酶混合物的实例可以是蛋白酶，如蛋白酶K、脂酶或糖苷酶。化学物质的非 限制性的实例为例如尼格罗霉素（nigromycin)的离子载体，例如十二烷基硫酸钠的洗涤 剂、酸或碱；和物理方法的非限制性的实例是例如弗氏压碎器（Frenchpressing)的高压， 摩尔渗透压浓度，温度如热或冷。裂解细胞的首选方法是使细胞冻融。另外，除了蛋白水解 酶、酸、碱等，也可以使用合适的酶的组合。
[0028] 根据本发明，术语"裂解物"是指含有通过裂解肿瘤细胞产生的细胞蛋白和因子的 水溶液或悬浮液。这样的裂解物可以包括大分子，如DNA、RNA、蛋白质、肽、碳水化合物、脂类 等，和/或小分子，如氨基酸、糖、脂质酸等，或来自裂解的细胞的碎片。存在于所述裂解物 中的细胞碎片可以是平滑的或粒状的结构。优选地，所述水介质是水，生理盐水或缓冲液。
[0029] 根据本发明的所述裂解物不限于裂解的坏死细胞。例如，由于处理的细胞的不同 敏感性，或由于处理条件，如UVB辐射，裂解的凋亡细胞也可以形成裂解物或成为裂解物的 一部分。
[0030] 如本文所用的术语"裂解物"也包括从上述裂解物中获得的制剂或片段。这些片段 可以通过本领域技术人员公知的方法获得，例如色谱法，包括，例如亲和层析、离子交换层 析、大小排阻层析、反相层析和其它位于层析柱或分批法中的材料的层析，其它分级方法， 例如过滤方法，例如超滤、透析、离心中尺寸排阻透析和浓缩、密度梯度或阶梯阵矩（step matrices)离心、沉淀，例如亲和沉淀，盐溶或盐析（硫酸铵沉淀），醇沉淀，或其它蛋白质化 学，分子生物学，生物化学，免疫学，化学或物理方法来分离上述裂解物的组分。在一种优选 的实施方案中，优选那些比其他具有更强的免疫原性的片段。本领域的技术人员能够选择 合适的方法，并通过上述的一般说明和本文实施例中的具体说明，如果有必要，并适当地修 改或改变这些方法来确定其免疫原性潜力。
[0031] 优选地，在肿瘤细胞中诱导坏死或凋亡之前，将间皮瘤肿瘤细胞的免疫原性增强。 这种免疫原性的增加可以通过在41. 2°C或更高温度下孵育同种异体肿瘤细胞1-120分钟， 优选20-50分钟，最优选约30分钟来实现。另一种增加肿瘤细胞的免疫原性的方法是通过 将肿瘤细胞暴露于氧化修饰，例如将细胞暴露于次氯酸或过氧化氢中来实现。同种异体肿 瘤细胞的免疫原性也可通过将细胞暴露于组蛋白脱乙酰酶抑制剂，如丙戊酸或辛二酰苯胺 异轻S亏酸（suberoylanil