珍珠母蛋白n16在制备抑制破骨活性药物中的应用
【专利说明】珍珠母蛋白N16在制备抑制破骨活性药物中的应用
[0001] 技术邻域
[0002] 本发明涉及珍珠母蛋白N16在制药领域中的一种新用途。
【背景技术】
[0003] 在人的骨头里，有成骨细胞和破骨细胞。成骨细胞是促进新骨的形成，破骨细胞则 是消化旧骨。但当骨细胞间的平衡发生变化，破骨细胞活性大于成骨细胞功能时，骨量就会 加速丢失，骨质也就变得日渐疏松。破骨细胞活性增强可导致骨质脱钙、骨脆性增加、生长 受抑、长骨变粗及骨关节疼痛。【背景技术】
[0004] 研究报道，珍珠母蛋白具有促进成骨活性，能促进骨损伤修复，显着提高去卵巢大 鼠的骨密度，提高新生鼠颅骨的原代培养细胞和MRC-5 (人类胎儿成纤维细胞系）细胞的碱 性磷酸酶活性，刺激成骨细胞的分化和产生矿化结节，促进骨形成。珍珠母蛋白具有良好的 生物相容性，安全性高。在国内外，珍珠母粉被认为是一种良好的骨组织替代材料。珍珠母 移植或透皮注射到动物体内无免疫排斥反应或明显毒副作用。
[0005] 珍珠母蛋白N16是属于珍珠母蛋白，分子量为16kDa，在1999年由Samata等人在 珍珠母不溶于水的组分中发现。研究表明，N16能影响碳酸钙结晶的形状。但珍珠母蛋白 N16抑制破骨活性的作用，尚未见文献报道。
【发明内容】
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为制备抑制破骨活性药物提供一种新途径，即提供珍珠母蛋白 N16在制备抑制破骨活性药物中的应用。
[0007] 所述抑制破骨活性药物可以制成任何临床上适用的药物制剂，如片剂、胶囊剂、颗 粒剂、注射剂等。
[0008] 本发明是首次将珍珠母蛋白N16应用于抑制破骨活性药物中。为抑制破骨活性药 物提供了一种全新的选择和思路，拓宽了抑制破骨活性药物的选择领域。
【附图说明】
[0009] 图1为本发明中基因重组的珍珠母蛋白N16的15% SDS-PAGE图；
[0010] 图2为珍珠母蛋白N16抑制前体破骨细胞RAW 264. 7的增殖结果图；
[0011] 图3为N16抑制前体破骨细胞RAW 264. 7分化实验的结果；
[0012] 图4为珍珠母蛋白N16抑制破骨细胞actin ring的形成结果。
【具体实施方式】
[0013] 以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0014] 各实施例中所涉及的固体混合物中之固体，液体中之液体，以及液体中之固体的 百分比分别是以wt/wt、vol/vol、wt/vol计算，除非另有说明。
[0015] 实施例1 :珍珠母蛋白N16的制备
[0016] 珍珠母蛋白N16的制备方法，具体包括以下步骤：
[0017] 从马氏珠母贝Pinctada fucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA。
[0018] 根据NCBI数据库珍珠母蛋白N16的基因序列，设计引物珍珠母蛋白N16F
[0019] (5,-GGAATTC 通謎塵 GCTGT CCAT TATAAGTGC-3'）和珍珠母蛋白 N16R
[0020] (5' -CG GGATCC TTAAITGTCAAACCGITC-3'），其中下划线部位碱基分别为 Ndel 和 BamHI限制性内切酶位点。利用PCR法扩增珍珠母蛋白N16基因，反应程序设为95。。1分 钟，50°C 20秒，72°C 1分钟，共25个循环，最后72°C 10分钟。扩增所得珍珠母蛋白N16 基因连接到表达载体pET3 a 上，并导入BL21(DE3)plysS competent Escherichia coli，用 于表达 N16 蛋白。当 BL21(DE3)plysS competent Escherichia coli 生长到对数期，加入 0. 4mM IPTG，37°C诱导珍珠母蛋白N16的表达。16h后，收集菌体。
[0021] 珍珠母蛋白N16的纯化：将表达菌体分散在20mM Tris-HCl (pH 7. 0)中，超 声破碎，离心，弃上清。不溶物以 washing buffer (2M urea, 20mM Tris, 0.1 % Tween 20, pH 7.0)超声溶解。离心，收集不溶物，再以 solubilizing buffer(8M urea, 20mM Tris，40mM beta_mercaptoethanol，pH 7.0)室温溶解过夜。离心，取上清，0.45iim 滤 膜过滤。以DEAE柱子对N16进行初步纯化以及浓缩，其中，上样缓冲液为8M urea，20mM Tris，40mM beta-mercaptoethanol，pH 7.0，洗脱液为 8M urea，20mM Tris，40mM beta-mercaptoethanol, 1M NaCl，pH 7.0,洗脱方式为梯度洗脱。15% SDS-PAGE 检测珍珠 母蛋白N16。收集含珍珠母蛋白N16的洗脱液，超滤浓缩，以Superdex 75柱子进行凝胶排 阻层析，分离纯化珍珠母蛋白N16。15% SDS-PAGE检测珍珠母蛋白N16的纯度。
[0022] 结果见图1。重组表达所得到的珍珠母蛋白N16,分子量约为16kDa，与预测结果相 吻合。纯度高，无明显可见杂蛋白条带，可用于后续实验。
[0023] 实施例2 :珍珠母蛋白N16抑制前体破骨细胞增殖
[0024] 采用小鼠前体破骨细胞株RAW 264. 7,于100U/mL青霉素，100g/mL链霉素的DMEM 培养液中培养，培养细胞置于37°C、饱和湿度5% 0)2浓度下，2~3天换液1次。取对数生 长期生长状态良好的细胞以3~5 X 103个/孔接种于96孔培养板，每孔180 y 1。37°C、5 % C〇2培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，实验组加入不同浓度的珍珠母蛋白N16,每个 浓度设4个复孔。同时设阴性对照组（N16 = 0 y M)。继续培养24、48、72小时。MTT法检 测细胞增殖情况。
[0025] 结果见图2。图2中设阴性对照组（珍珠母蛋白N16 = 0 yM)增殖率为100%。 (One-way AN0VA，*:P〈0. 05, **:P〈0. 01，***:P〈0. 001，与阴性对照组比较。）
[0026] 珍珠母蛋白N16能抑制前体破骨细胞RAW 264. 7细胞的增殖，其抑制作用具有时 间依赖性和浓度依赖性。作用48小时和72小时，珍珠母蛋白N16对RAW264. 7细胞增殖半 数抑制率的浓度分别约为20 y M和12 y M。
[0027] 实施例3 :珍珠母蛋白N16抑制RANKL诱导RAW 264. 7细胞向破骨细胞分化
[0028] 采用对数生长期生长状态良好的RAW264. 7细胞，以1~3X 103个/孔接种于96 孔培养板，每孔180 y 1。37°C、5% C02培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，弃去原培养 基，更换为含50ng/ml RANKL的<1-|^11培养基。实验组加入不同浓度的珍珠母蛋白附6，每 个浓度设4个复孔。同时设阴性对照组（含50ng/ml RANKL，不含珍珠母蛋白N16)和正常 对照组（不含50ng/ml RANKL)。继续培养72小时。酸性磷酸酶染色法检测破骨细胞，酸性 磷酸酶活性测定试剂盒测定TRAP活性，phalloidin-FITC荧光染色法测定破骨细胞actin ring的形成。
[0029] 结果见图3、图4。图3中，A为TRAP染色结果。B为多核破骨细胞数目统计结果。 C为TRAP活性测定结果。黑色箭头所示为多核破骨细胞。标尺为200iim。（Non-paired Student's t-test, #:P〈0. 05, ##:P〈0.01, ###:P〈0. 001，阴性对照组（RANKL)与空白对 照组（狀疆1-)比较；01^1&7厶勵￥厶，*:?〈0.05，#:?〈0.01，*林:？〈0.001，与阴性对照组 (RANKL)比较。
[0030] 图3A为TRAP染色结果。RAW 264. 7细胞在RANKL的诱导下，能分化成为多核破 骨细胞（核数目>3)，细胞体积增大，TRAP表达增多，TRAP染色呈紫红色。珍珠母蛋白N16 能抑制RANKL诱导RAW 264. 7细胞分化成为成熟的破骨细胞。统计每组多核破骨细胞的数 目并比较每组差异，统计结果见图3B。可见珍珠母蛋白N16对多核破骨细胞形成的抑制作 用具有浓度依赖性（IC M= 0. 5 yM)。TRAP是破骨细胞分化的标志性酶。测定TRAP活性， 结果见图3C。珍珠母蛋白N16抑制RAW 264. 7细胞TRAP的活性（IC5Q= 0. 6 y M)，该抑制 作用具有浓度依赖性。Actin ring是破骨细胞吞噬旧骨时所必需形成的结构，对破骨细胞 的进行骨吸收具有重要意义。phalloidin-FITC荧光染色结果显示，在不含珍珠母蛋白N16 的RANKL诱导的RAW 264. 7细胞中形成了明显的actin ring。珍珠母蛋白N16抑制actin ring的形成。在含珍珠母蛋白N16的实验组中，actin ring形成的数目减少，体积变小。 上述实验表明，珍珠母蛋白N16对破骨细胞的分化具有抑制作用。图4中，白色箭头所示为 actin ring。标尺为 200iim〇
[0031] 实施例4 :珍珠母蛋白N16抑制破骨细胞分化相关基因的表达
[0032] 采用对数生长期生长状态良好的RAW264. 7细胞，以，3~5X 104个/孔接种于6 孔培养板。37°C、5%C02培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，弃去原培养基，更换为 含50ng/ml RANKL的a-MEM培养基。实验组加入不同浓度的珍珠母蛋白N16。同时设阴性 对照组（含50ng/ml RANKL，不含珍珠母蛋白N16)和空白对照组（不含50ng/ml RANKL)。 继续培养72小时。弃去原培养基，Trizol法提取mRNA，逆转录得cDNA，实时定量PCR法 (qPCR)测定破骨细胞分化相关基因的表达情况。
[0033] 表1实施例2中所用到的引物
[0034]
[0035] TRAP、c-Src、Cath印sin K和转录因子NFATcl与破骨细胞分化相关。TRAP是破 骨细胞分化标志性酶，缺乏c-Src、Cathepsin K会损伤破骨细胞的骨吸收功能。转录因子 NFATcl是RANKL诱导破骨细胞成熟通路中的重要因子。RANKL通过MAPK细胞信号通路，激 活转录因子NFATcl，从而引起一系列下游破骨细胞分化相关因子的表达，从而诱导破骨细 胞分化成熟。表2中的数据为实验组与空白对照组相应基因表达量比较的倍数。阴性对照 组中，TRAP、c-Src、Cath印sin K和转录因子NFATcl在RANKL的诱导下，表达量增高。加入 珍珠母蛋白N16后，能抑制TRAP、c-Src、Cath印sin K和转录因子NFATcl的表达，表明珍珠 母蛋白N16能抑制破骨细胞的分化成熟。
[0036] 表2 N16对破骨细胞分化相关基因的表达影响（mean土SD)
[0037]
[0038] (One-way AN0VA，* :P〈0. 05, ** :P〈0. 01，*** :P〈0. 001，与阴性对照组比较）。
【主权项】
1. 珍珠母蛋白N16在制备抑制破骨活性药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型是片剂、胶囊剂、颗粒剂、注 射剂或鼻吸入剂。
【专利摘要】本发明涉及珍珠母蛋白N16在制药领域中的一种新用途。具体为公开了珍珠母蛋白N16在制备抑制破骨活性药物中的应用。本发明首次发现珍珠母蛋白N16具有抑制破骨活性。本发明为目前破骨活性增强等疾病的治疗提供了一种全新的选择和思路，也为该技术领域的发展做出了贡献。
【IPC分类】A61K38/17, A61P19/08
【公开号】CN105056210
【申请号】CN201510420589
【发明人】苏薇薇, 李沛波, 邵鹏柱, 王永刚, 彭维, 马结仪, 吴忠
【申请人】中山大学深圳研究院, 中山大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月16日