用于激光诱导纳米微球释放内含物的组合物和方法
【专利说明】用于激光诱导纳米微球释放内含物的组合物和方法
[0001] 参考相关的应用
[0002] 本专利申请要求于2012年12月19日提交的美国临时专利申请号61/739, 503的 优先权，以上临时专利申请的公开内容以引用的方式并入本文。
[0003] 关于联邦政府赞助研究的声明
[0004] 此项发明由美国政府，国家卫生机构资助，项目编号R01EB017270和 DP50D017898。政府对这项发明拥有一定版权
【背景技术】
[0005] 递送药物至靶组织与药物输送同等重要，临床上已经批准一些纳米载体，并且用 来提高一些药物的生物分布和药效。然而，这种递送受到生理屏障和动力学释放的阻碍，以 至于生物分布和生物可利用性难以达到最佳水平。目前外源性诱导装载物释放的最佳可行 方式是通过间接或直接加热，使其周围温度略高于正常体温，以此来促进纳米载体系统释 放其内容物。但是，这种机制尚不能轻易的控制激发药物的释放，在正常体温状态下，较小 的温度调节范围阻碍载体稳定性。
【发明内容】
[0006] 本发明公开了 一种自组装纳米颗粒，该纳米材料包括有卟啉-磷脂偶合物。 纳米微球包括目前已经公开的卟啉-磷脂偶合物一一在这里指卟啉_磷脂纳米微球 (PoP-NVs)或者卟啉-磷脂纳米脂质体（PoP-脂质体），当没受到近红外激光（NIR)照射时 (650-1000nm)，它们可稳定的负载内含药物，还可利用NIR的照射来实现对药物的控制释 放。
[0007] 这里介绍了纳米微球包含双分子层，该双分子层由卟啉偶合物构成。卟啉偶合物 包含一条烷基醚侧链和一分子磷脂。同时介绍了纳米微球的组成以及合适的载体缓冲液。
[0008] 这里我们还将介绍将目标药物装载到纳米微球的方法，以及在体内、外控制药物 传递的方法。
【附图说明】
[0009] 图1. LQ-BIC能量细胞有R A卟啉双分子单体，它有稳定装载药物的能力。a) pyro-lipid和焦脱镁叶绿酸己醚（HPPH)的化学结构。b)单独形成的纳米微球单体和装载 有钙黄绿素的纳米微球吸收光谱。c)HPPH磷脂（这里也被乘坐焦脱镁叶绿酸己醚-脂质） 双分子层能够稳定负载药物，但pyro-lipid不能。这两种单体都可以合成并参与组成能装 载钙黄绿素的纳米微球，它可以在一定的浓度下荧光自淬灭。在检测荧光之前，纳米微球和 未被包裹的钙黄绿素会被分开。实验检测纳米微球中含有钙黄绿素的荧光和加入〇. 25% Triton X 100后的荧光。
[0010] 图2.卟啉-磷脂偶合物的掺入对近红外光照射调节纳米微球渗透近红外光对 含有卟啉-磷脂纳米球的穿透调节。a)PoP-NVs包含5%乙烯二醇脂，35%胆固醇和60% 05卩(：。采用即?11-磷脂来逐步置换05?(：。13)卟啉-磷脂展现出99.97%的荧光自淬灭（完 整的纳米微球的荧光和加入清洁剂后的的荧光比较）。
[0011] 图3.激光诱导卟啉-磷脂纳米微球装载。纳米微球与2mM钙黄绿素溶液混合并 用激光（120mW、658nm)照射3分钟。未结合的钙黄绿素与卟啉-磷脂纳米微球结合的钙黄 绿素通过凝胶过滤的方式分开，并检测钙黄绿素与HPPH-磷脂的发射荧光值的比率。
[0012] 图4.在无大体积溶液加热时，该材料出现药物渗透现象。实验对钙黄绿素的释放 及含有卟啉-磷脂纳米微球溶液的温度进行了测定。a)无激光照射b)有激光照射（150mW， 658nm)。实验运用热电偶以30秒/次检测溶液中温度的变化。
[0013] 图5.赋予卟啉-磷脂纳米微球热稳定性的图例展示。掺入包裹钙黄绿素的卟 啉-磷脂纳米微球到有或者没有10个摩尔百分比HPPH磷脂的已知温度盐溶液中混合10 分钟。并分别给予或不给予激光照射3分钟的预处理。
[0014] 图6.在没有游离HPPH时，掺入HPPH磷脂可有效的被激光激活而释放。a)运用激 光照射含有10个摩尔百分比HPPH磷脂的卟啉-磷脂纳米微球释放的钙黄绿素。b)通结合 有单独HPPH的脂质体在血清中能够迅速再分布，而含有HPPH-磷脂的脂质体无此现象发生 (经去淬灭荧光检测）。
[0015] 图7.在卟啉-磷脂纳米微球中阿霉素装载及其装载后的可调节性释放示例图。a) 凝胶过滤显示阿霉素可经主动载药方式负载到卟啉-磷脂纳米微球中。当脂质与药物比率 为10 :1并与纳米微球在60°C混合1小时，95%以上的阿霉素可被装载入纳米微球中。b) 卟啉-磷脂纳米微球对药物释放具有可调节性。在含有10%血清的培养基中，装载有阿霉 素的卟啉-磷脂纳米微球被激光以不同时间及激光能量予以照射处理。经三次独立实验后 得到标准误差。
[0016] 图8.流动速率影响药物从卟啉-磷脂纳米微球中释放的示例图。在规定的流速 和激光照射下，装载钙黄绿素的卟啉-磷脂纳米微球经过毛细血管并在血管出口处检测其 释放量的变化。
[0017] 图9.阿霉素是通过加入硫酸铵并与10%血清的培养基在37°C混合2天的方式装 载到卟啉-磷脂纳米微球的示例图。孵育后，将混合物样本用658nm激光照射5分钟后立 即检测其中的药物释放量。
[0018] 图10?图例a)在150ns分子动力刺激后，HPPH磷脂和pyro-脂质的密度。b)氢 键在500ns分子动力时的形成过程。实验显示了在每种类型卟啉-脂质分子间及分子内部 氢键的形成情况。c)给予500ns分子动力刺激后，测定卟啉-磷脂的链序参量。链序参量 表示脂质链顺序与对应的双分子层正常区域的一致性。
[0019] 图11.在没有大体积或者纳米级热量存在时，扑啉_脂质的掺入使得可用近红外 光调节的脂质体药物释放。a)含有1摩尔百分比的5-DSA作为标记的卟啉-磷脂脂质体电 子自旋共振样本，其温度到达50°C时会被记录下来。b)卟啉-磷脂脂质体的5-DSA的电子 自旋共振波谱具有温度依懒性。c)实验尚未对给予激光照射卟啉-磷脂脂质体产生纳米级 热量给予证明。激光诱导混合物互相混匀前、混匀中及混匀后并设置不同温度时，实验对含 有5-DSA的卟啉-磷脂脂质体中心电子自旋共振波峰到波谷的宽度进行了测定。
[0020] 图12.用HPPH磷脂掺入到卟啉-磷脂脂质体中产生热稳定性并难易改变的示例 图。在其变为流动相并且固态化之前，装载有磺基B的卟啉-磷脂脂质体加入到热的琼脂 糖中（温度不超过60°C)。运用激光照射调节药物释放，它具有高的空间立体可控性并用 其拼写出"UB"的字样。注意：原料是均匀分布在琼脂糖各处。
[0021] 图13.在空间和时间上控制卟啉-磷脂脂质体渗透性的示例图。a)实验对在空 间上激光照射诱导抗生素释放杀伤枯草芽胞杆菌进行了测定，装载庆大霉素的卟啉-磷脂 脂质体包埋入含有细菌的热琼脂糖中。在这些包埋孔处给予激光照射处理10分钟（波长 658m，200mW/cm 2)，并在24小时后拍照。b)在pac-1细胞接种的小鼠移植瘤中，通过控制温 度变化调节药物释放。分别把5nmol包裹有磺基B和游离磺基B的卟啉-磷脂脂质体，以 自我淬灭浓度注射入移植瘤内，并对这些小鼠进行成像。文中展示了在指定的时间点和条 件下的代表性图片。2小时后给予激光照射处理，每组展示了各自代表性的图片结果并且每 个处理组含有3只小鼠。
[0022] 图14.经主动载药方式负载的药物（阿霉素）在卟啉-磷脂脂质体中可以进行调 节性释放或者按需求释放。a)凝胶过滤展示具有活性的阿霉素装载到卟啉-磷脂脂质体 中。阿霉素与卟啉-磷脂脂质体混合后，脂质与药物比率为10 :1并置于60°C孵育1小时 后，阿霉素-卟啉-磷脂脂质体中可含95%以上的阿霉素。b)脂质体凝胶过滤后给予激光 照射处理，结果显示了激光诱导药物释放的高效性。c)运用卟啉-磷脂脂质体实现药物释 放的可调节性。在含10%血清的培养基中，不同照射次数及激光能量处理包裹有阿霉素的 卟啉-磷脂脂质体。并用荧光来评价其释放量。Mean土SD标准误差（实验独立重复3次）。 d)阿霉素_卟啉-磷脂脂质体稳定的在37摄氏度10%血清的培养基中孵育2天，并给予 激光（4min、300mW)照射处理。Mean土SD标准误差（实验独立重复3次）e)阿霉素-卟 啉-磷脂脂质体在体外的细胞杀伤作用。Panc-1细胞与10 y g/mL的阿霉素共同孵育24小 时，并给予激光（10min、200mW/cm2)照射处理。运用XTT方法检测24小时后的细胞活性。 Mean土SD标准误差（实验独立重复8次，运用单因素方差post-hoc分析，与其它各组相比 较，激光照射+阿霉素-卟啉-磷脂脂质体对细胞活性具有明显抑制作用，P〈〇. 001)。
[0023] 图15.特征性的图例a)在激光照射前后，实验对阿霉素-卟啉-磷脂脂质体进行 低温电镜成像，箭头所示为脂质体中阿霉素的聚集。b)在激光诱导阿霉素-卟啉-磷脂脂 质体释放的前、后，实验对动态光散射大小、多分散性指数及电动电势的变化进行了测定。 c)含有钙黄绿素的卟啉-磷脂脂质体，经激光周期性的照射处理后呈现出短时诱导的通透 性。d)空载的卟啉-磷脂脂质体在2mM的钙黄绿素溶液中混合并用激光（3min、120mW)照 射处理。通过凝胶过滤，游离的钙黄绿素和卟啉-磷脂脂质体包裹的钙黄绿素被分开。运用 不同的激发波长和发射波，检测钙黄绿素与HPPH的发射荧光比率，Mean土SD标准误差（实 验独立重复3次）。
[0024] 图16.实验对阿霉素-卟啉-磷脂脂质体进行全身性给药、单次抗肿瘤激光治疗。 a)在激光照射、无激光照射时，阿霉素的生物分布情况。将阿霉素-卟啉-磷脂脂质体以 含阿霉素l〇mg/kg的剂量经尾静脉注射到接种有KB肿瘤的裸鼠上，采用200mW/cm2的激光 (658nm)照射肿瘤12. 5分钟（150J/cm2)。Mean土SD每组有7-8只小鼠，采用平均值土标 准差来显示。b)接种KB肿瘤裸鼠的卡氏生存曲线。肿瘤大小达到4-6mm时，给予单次处 理，当任意径线测量肿瘤达1〇_时，即处死小鼠。分别用等剂量（以阿霉素l〇mg/kg计算） 的阿霉素-卟啉-磷脂脂质体、单纯卟啉-磷脂脂质体处理小鼠（5-7只/组）。
[0025] 图17. 10个摩尔百分比的游离HPPH有效装载到脂质体的代表性示例图。由50摩 尔百分比的DSPC、35摩尔百分比的胆固醇、5摩尔百分比的DSPE-PEG2K和10摩尔百分比的 游离HPPH组成的混合液，通过薄血片法、盐溶液溶解、声波振荡及凝胶过滤的方式最终形 成脂质体。脂质体洗脱成份及游离分子被分选。在进行HPPH荧光检测前，所有样本均溶解 在三硝基甲苯（〇.25%、Triton-X 100)中。
[0026] 图18.包裹10个摩尔百分比的HPPH-磷脂及10个摩尔百分比单独HPPH的卟 啉-磷脂脂质体的荧光自我淬灭代表性图例。脂质体是由50摩尔百分比的DSPC、35摩尔百 分比的胆固醇、5摩尔百分比的DSPE-PEG2K和10摩尔百分比的HPPH-磷脂或者单纯10摩 尔百分比的HPPH组成。包裹有10摩尔百分比的HPPH-磷脂的脂质体呈现出97%的HPPH 荧光淬灭，然而脂质体中存在10摩尔百分比游离的HPPH表现出92%的荧光淬灭。样本置 于PBS中，用三硝基甲苯（0. 25%、Triton-X 100)溶解脂质体。
[0027] 图19. HPPH-磷脂不会干扰两性霉素B装载到磷脂层中。包裹有两性霉素B的脂 质体是由所需脂质或游离两性霉素B经10mg的薄膜进行薄膜水化而成。它经过声波振荡 和过滤后得到溶剂中两性霉素B的百分比，并用荧光检测过滤液中两性霉素B的百分含量。
[0028] 图20