一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 印度刺猜蛋白（IndianHedgehog,Ihh)与创伤性骨关节炎（Post-traumatic osteoarthritis,PT0A)相关，在膝关节前交叉韧带（AnteriorCruciateLigament,ACL) 损伤的早期阶段Ihh表达增高，而ACL损伤后最终将发展成为PT0A。在动物实验中，运用条 件性基因敲除小鼠敲除成年小鼠关节软骨中的Ihh基因能够减缓ACL损伤导致PTOA的发 生降低。因此，敲除Ihh基因可以作为一个靶向基因来治疗PT0A。然而，目前的Ihh基因敲 除技术无法运用转基因小鼠以外的其他动物及人体PTOA的治疗，并且化学的Ihh抑制剂能 够产生严重的毒副作用，包括：前脑无裂畸形、唇腭裂、肢体发育障碍等。因此，目前非常有 必要找到一种安全有效的方法敲除关节软骨内Ihh基因来治疗PT0A。
[0003] 关节软骨表层非常致密，由软骨细胞和细胞外基质组成，而后者主要由II胶原 和被其包绕的蛋白多糖组成。一些临床I-III期的实验研究证实通过RNA干扰的方式 沉默特定的基因能够对人体疾病起到有效的治疗作用（PignatelloR,SarpietroMG, CastelliF.Synthesisandbiologicalevaluationofanewpolymericconjugate andnanocarrierwithosteotropicproperties.JFunctBiomaterMarch2012; 3(1) :79-99.ZhangG,GuoB,WuH,TangT, ZhangBTjZhengL,HeY, YangZ,PanX, ChowH,ToKjLiY,LiD，WangX，WangY，LeeK，HouZ,DongN，LiG，LeungK， HungL，HeF，ZhangL，QinLAdeliverysystemtargetingboneformationsurface tofacilitateRNAi-basedanabolictherapy.NatMed2012; 18(2) :307_14)D 然而， 鉴于关节软骨的组织结构特点，其表面又带有大量负电荷，单独的siRNA不能进入软骨细 胞内，目前尚缺乏有效并且安全的软骨siRNA递送系统，限制了RNAi在治疗软骨疾病中的 应用。
[0004] 脂质体具有良好的生物相容性，已被广泛用作药物载体，能够使包封的药物具有 较好的稳定性，并且在一定程度上能够降低药物的毒副作用。在骨组织领域运用比较成熟 的是一种脂质体纳米递送系统（LipidNanoparticle,LNP)，它为骨革E向脂质体（ZhangG, GuoB,WuH,TangT,ZhangBT,ZhengL, HeY, YangZ,PanX, ChowH, ToK, Li Y,LiD,WangX,WangY,LeeK,HouZ, DongN,LiG,LeungK, HungL,HeF, ZhangL,QinLAdeliverysystemtargetingboneformationsurfacetofacilitate RNAi-basedanabolictherapy.NatMed. 2012; 18(2) :307_14)，但由于骨组织与软骨组 织是不同的组织，这类脂质体纳米递送系统的脂质体上面携带骨靶向分子，能够定向地将 脂质体与骨组织结合，而无法与骨以外的组织结合，因此这类脂质体纳米递送系统并不能 运用于软骨组织。
[0005] 申请号为201110156949. 7,名称为基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及 其制备方法的发明专利，提供了一种基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备 方法。该骨靶向递送系统包括脂质体、骨靶向分子和小核酸药物，所述骨靶向分子选自双磷 酸盐、8个天门冬氨酸多肽重复序列、6个天门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸多肽重复序列和针 对成骨样细胞筛选出的适配子中的一种或几种，所述小核酸药物选自具有促进骨形成功能 的小干扰核糖核酸、微小核糖核酸的模拟物和微小核糖核酸的阻断剂中的一种或几种。本 发明相比传统的骨靶向递送系统具有更强的专属性和特异性，小核酸药物转染效率高，能 够达到较高的沉默效率。而该专利所制备的骨靶向递送系统是脂质体肌肉注射或者静脉注 射，然后脂质体通过靶向分子将脂质体带入骨组织，从而作用于骨组织，但是该骨靶向递送 系统无法将脂质体靶向进入软骨组织中。
【发明内容】
[0006] 本发明为了解决目前缺乏有效并且安全的软骨SiRNA递送系统，限制了RNAi在治 疗软骨疾病中的应用，提供了一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及其制备方法。
[0007] 本发明由如下技术方案实现的：一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统， 包括脂质体、脂质体修饰物和小核酸药物，所述脂质体为磷脂酰胆碱DPPC、胆固醇、 Dlin-KC2-DMA;所述脂质体修饰物为聚乙二醇脂质共辄物C-PEG，所述小核酸药物为Ihh siRNA;所述磷脂酰胆碱DPPC浓度为35mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为 11. 72% ;胆固醇浓度为9. 5mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为23. 85% ;聚乙 二醇脂质共辄物C-PEG浓度为50mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为16. 74% ; Dlin-KC2-DMA的浓度为28. 5mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为47. 69%。所 述小核酸药物的靶序列为SEQIDNO:2,即IhhsiRNA的第1708-1734位碱基序列。
[0008]所述IhhsiRNA在Genebank中SequenceName:ACCNM_053384. 1，喊基序列为 SEQIDNO:1，其正义链为：5 '-rGrArArGrGrArGrCrCrUrGrGrArUrGrUrCrCrUrUrGrCrCAC _3' ；反义链为：5'-rGrUrGrGrCrArArGrGrArCrArUrCrCrArGrGrCrUrCrCrUrUrCrCrC-3'； 本发明选用IhhsiRNA碱基序列中第1708-1734位碱基序列作为靶序列。
[0009] 用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统的制备方法包括以下步骤： (1) 混合脂质体：将2ul磷脂酰胆碱DPPC、15ul胆固醇、2ul聚乙二醇脂质共辄物、 IOul的Dlin-KC2-DMA混合，然后加入乙醇将脂质体溶解，形成A液； (2) 将20uM、IOul的IhhsiRNA加入55ul的柠檬酸盐缓冲液，形成B液； (3) 将A液加入B液中混合均匀，形成AB混合液； (4) 在AB混合液中加入400ul的PBS缓冲液洗涤，然后在超滤离心管中12000r离心 5min； (5) 用PBS重复洗涤离心3次，离心后所获得的80-100ul液体即为软骨siRNA脂质体 递送系统。
[0010] 所述柠檬酸盐缓冲液的浓度为50mM，pH为4。
[0011] 本发明修饰了脂质体纳米为基础的软骨RNA干扰递送系统（LipidNanoparticle (LNP)-basedcartilageRNAiDeliverySystem)。包装形成LNP-siRNA复合物系统，此复 合物带有正电荷，并且安全、体积小能够分布到全层软骨组织中。本发明把包含有siRNA的 脂质体注射入关节腔内，利用阴阳电荷相互吸引而将脂质体变相地靶向递送入关节软骨细 胞，成功敲除软骨细胞内的Ihh基因。本发明安全有效的敲除关节软骨内Ihh基因，可以作 为一个靶向基因来治疗PTOA。通过载体实验证实，修饰后的LNP能够将Ihh-siRNA递送入 软骨细胞，成功敲除软骨细胞内的Ihh基因。突破了软骨组织中基因敲除的瓶颈，解决了这 一难题。本发明安全有效的敲除关节软骨内Ihh基因，可以作为一个靶向基因来治疗PTOA。
[0012] 本发明所述的脂质体米用的是通用脂质体，可以递送任何siRNA，siRNA是一种小 RNA分子，不同的蛋白均可通过其相应的siRNA将此蛋白的基因敲除，使得这个蛋白不表 达