一种脑靶向的仿生纳米药物递释系统的制备及在治疗脑胶质瘤中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种主动靶向脑胶质瘤递送药物的仿生纳米 递药系统及其制备方法。本发明的递药系统载体是一种天然的小粒径脂蛋白，由具有主 动靶向性的功能肽修饰，通过表达于血脑屏障的低密度脂蛋白受体相关的跨膜受体蛋白 LRP-I介导透过血脑屏障，同时由低密度脂蛋白受体和LRP-I介导革巴向于胶质瘤，针对胶质 瘤细胞，胶质瘤干细胞和胶质瘤新生血管进行多靶点杀伤，实现治疗作用。
【背景技术】：
[0002] 脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，发生于神经外胚层，来源于星型细 胞或少突胶质细胞，占颅内肿瘤的35~60%。世界卫生组织数据显示，脑胶质瘤是35岁以 下中青年第2号肿瘤杀手，每年约有60万中青年被恶性脑胶质瘤夺去生命。胶质瘤体呈强 侵袭性生长特点，外科手术不易将其与正常脑组织区分开因此手术治疗效果较差，且预后 效果不佳。有研究表明，即使99. 9%的肿瘤组织被手术切除，残余的0. 1 %也会迅速增殖， 增殖周期仅为3~7d。因此术后的放化疗策略对于脑胶质瘤的治疗具有非常重要的意义。 但是由于血脑屏障（thebloodbrainbarrier,BBB)的生理屏障作用，使得化疗药物难以 透过BBB并进入肿瘤组织起到杀伤肿瘤细胞的作用。肿瘤靶向纳米递药系统成为胶质瘤治 疗的重要研究内容。
[0003] 有研究证明血脑屏障特异性表达低密度脂蛋白受体相关的跨膜受体蛋白 (low-densitylipoproteinreceptor-relatedproteinl，LRP-l)〇Angiopep-2 是 19 个 氨基酸组成的短肽，分子量2. 4kD，氨基酸序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY(SEQIDNO:I)，与 LRP-I具有高亲和力。其氨基酸序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY(SEQIDN0:1)。它拥有与 转铁蛋白（transferrin)、乳铁蛋白（Iactoferrin)和抗生物素蛋白（avidin)相比，具有 更加高效的主动革E向透过血脑屏障的能力（KeW，ShaoK，HuangR，etal.Genedelivery targetedtothebrainusinganangiopep-conjugatedpolyethyleneglycol-modified polyamidoaminedendrimer[J].Biomaterials，2009,30(36) :6976-6985.;DemeuleM， CurrieJC，BertrandY，etal.Involvementofthelow-densitylipoprotein receptor-relatedproteininthetran-scytosisofthebraindeliveryvector Angiopep-2 [J].JNeuro-chem，2008,106 (4) :1534-1544.)因此可以作为革巴向配体修饰于 纳米药物载体，将药物输送入脑。
[0004] 作为外源性的物质，纳米药物载体的生物相容性尤为重要，有研究表明其毒性是 影响远期治疗作用的重要因素。脂蛋白是人体中天然的脂质运送载体，主要成分为甘油 酯、磷脂、胆固醇酯、游离胆固醇及蛋白。以脂蛋白为基础构建的仿生型纳米给药系统具有 良好的生物相容性，无免疫原性。此外，肿瘤细胞为快速分裂细胞，需要大量的胆固醇，因此 以脂蛋白作为药物载体对肿瘤组织具有天然的靶向优势。
[0005]LDL(低密度脂蛋白），是血液中胆固醇的主要载体。其核心约由1500个胆固醇 酯分子组成，是一种天然纳米系统，粒径约为22~27nm，内部为疏水性的脂质内核，主要 由胆固醇酯和少量的甘油三酯构成，有利于贮运亲脂性药物，内核表面覆盖磷脂层及游离 胆固醇，最外面包覆着载脂蛋白apoB，可与低密度脂蛋白受体（lowdensitylipoprotein receptor,LDLR)结合后通过内吞作用进入胞内溶酶体，在低pH环境下受体与LDL分离， LDLR重新回到细胞表面。有研究表明，LDLR在脑胶质瘤细胞上高表达。因此，LDL可作为脑 部药物递送系统的载体，经Angiopep-2修饰后携载药物跨越BBB，而后通过LDL与LDLR的 作用以及Angiopep-2与LRP-I的作用进一步介导药物靶向于肿瘤细胞起到杀伤作用。有报 道在LDL的核心中加入二十二碳六烯酸（DHA)，其脂肪酸链对LDL起到结构稳定的作用，增 加其在体循环中的稳定性和载药性能。（NikanjamM,GibbsAR,HuntCA,etal.Synthetic nan〇-LDLwithpaclitaxeloleateasatargeteddrugdeliveryvehiclefor glioblastomamultiforme.JControlRelease, 2007, 124:163-171.；KopeckaJ,Campia I,OliveroP，etal.ALDL-maskedliposomal-doxorubicinreversesdrugresistance inhumancancercells[J]?JControlRelease，2011，149:196-205.ReynoldsL，Mulik RS，WenX，etal.Low-densitylipoprotein-mediateddeliveryofdocosahexaenoic acidselectivelykillsmurinelivercancercelIs[J]?Nanomedicine(Lond)， 2014. 9(14) :2123-41.)
[0006] 中国专利申请CN201080038742. 3,发明名称为"多聚体肽结合物以及其应用"，申 请公布号为CN102596993A，该专利申请公开了一种涉及多聚体（例如，二聚体、三聚体）形 式的肽载体，其能够穿过血-脑屏障（BBB)或有效进入特定的细胞类型。这些多聚体肽 载体，当结合于药剂（例如，治疗剂）时，能够将药剂转运穿过BBB或进入特定的细胞类 型，可用于治疗神经系统的疾病。所述肽载体的至少一种包含Angiopep-l、Angiopep-2、 cys-Angiopep-2、Angiopep-2-cys、以及反向Angiopep-2 的氨基酸序列。
[0007] 中国专利申请CN201110034494. 1，发明名称为"低密度脂蛋白受体相关蛋白配 体多肽修饰的脑肿瘤靶向基因递释复合物"，申请公布号为CN102614524A，该专利申请 公开了一种低密度脂蛋白受体相关蛋白配体多肽修饰的脑肿瘤靶向基因递释复合物，由 Angiopep-2修饰的高分子载体和质粒DNA构成，所述的Angiopep-2修饰的高分子载体由阳 离子高分子材料、亲水性聚合物和Angiopep-2组成；所述的阳离子高分子材料与质粒DNA 的质量比是2~40:1。
[0008] Angiopep-2修饰纳米给药复合物有可能实现了脑革El向和胶质瘤双重革El向作用， LDL复合DHA作为载体再经Angiopep-2修饰尚无相关报道，而LDL-DHA-Angiopep-2 (之后 缩写为LDL-Ang)可模拟LDL通过LDL受体被细胞内吞，从而实现内源性物质被细胞再吞 噬，治疗效果佳，生物相容性好。另外，肿瘤干细胞是肿瘤细胞中一小部分具有干细胞性质 的细胞，具有很强的自我更新和分化能力，与肿瘤的发生、生长、复发、转移有关。肿瘤干细 胞具有免疫逃逸能力，并在肿瘤微循环的建立过程中也起到重要的作用。目前尚无有关在 靶向胶质瘤干细胞上进行治疗的相关报道。
[0009] 盐霉素（SAL)是一种环醚类的离子载体抗生素，可以作用于多种肿瘤干细胞。已 有文献证明，盐霉素可以选择性地作用于脑胶质瘤干细胞。有研究显示，其抗胶质瘤干细 胞机制可能有（I)SAL是外排栗P-糖蛋白的抑制剂，可以克服多种肿瘤细胞的耐药性；（2) SAL可以促进细胞凋亡，导致DNA损伤增加和CDKNlA/p21蛋白减少，从而提高癌细胞对辐 射或细胞毒性药物（如依托泊苷或阿霉素）的敏感性；（3)SAL通过抑制脂蛋白受体相关蛋 白6(LRP-6)来抑制WNT-CTNNB1/P-联蛋白信号通路；(4)SAL在细胞质膜和线粒体中通 过Na+/Ca2+交换导致胞质Ca2+增加，并诱导钙蛋白酶和细胞色素C介导的神经元细胞死亡 (NaujokatC,SteinhartR.Salinomycinasadrugfortargetinghumancancerstem cells.JBiomedBiotechnol,2012. 2012:950658.)
[0010] 目前尚无有关构建一种跨血脑屏障、针对胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞来源的新 生血管的多靶点靶向纳米递药系统的相关报道；更无有关采用LDL复合DHA作为载体，将 Angiop印-2修饰于表面载脂蛋白上，获得的一种新型的、生物相容性良好，并包载盐霉素的 纳米递药系统。
【发明内容】
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[0011] 本发明的目的在于提供一种跨血脑屏障、针对胶质瘤细胞、胶质瘤干细胞和肿瘤 新生血管的多靶点靶向纳米递药系统；即一种跨血脑屏障功能肽修饰低密度脂蛋白的纳米 药物递释系统。
[0012] 本发明的主要技术方案是，提供一种跨血脑屏障功能肽修饰低密度脂蛋白的纳米 药物递释系统，本发明首先将功能肽共价键修饰于低密度脂蛋白，然后通过核心重组法将 化学药物包载进入脂蛋白的核心，制备形成前述的脑靶向给药系统。
[0013] 本发明是将低密度脂蛋白与跨血脑屏障功能肽连接，共同靶向于脑胶质瘤。本发 明能使纳米药物递释系统透过血脑屏障并特异性的靶向于胶质瘤，为中枢神经系统肿瘤治 疗提供一种无创伤、高效的给药方式。
[0014] 本发明采用LDL复合DHA(二十二碳六稀酸）作为载体，DHA起到稳定脂蛋白结构 的作用。将Angiopep-2修饰于表面载脂蛋白上，获得的一种新型的、生物相容性良好，并包 载盐霉素的纳米递药系统。
[0015] 本发明的第一方面，是提供一种Angiopep-2修饰的纳米药物递释系统，S卩一种脑 革巴向的仿生纳米药物递释系统，本发明的纳米药物递释系统具体为一种Angiopep-2修饰 的LDL与DHA复合载体包载盐霉素的核心重组纳