一种可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米免疫技术领域，特别是涉及一种可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]树突状细胞(Dendritic cell, DC)是目前发现功能最强大的控制一系列免疫应答的高度特异化的抗原呈递细胞(Antigen presenting cell，APC)。树突状细胞可以调动多种免疫抵抗机制，例如CD8+T细胞、细胞毒T细胞、CD4+辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞以及自然杀伤T(NKT)细胞。这些淋巴细胞的每一种都具有识别和杀死患病细胞、以及释放保护性细胞因子(例如IFN- γ和CD4T细胞)的作用。DCs在体内外均能激发T细胞的增殖，诱导其产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)生成，并且是惟一能够激活幼稚T细胞的细胞类型，从而发挥抗肿瘤免疫效应。
[0003]DCs是免疫应答的核心，未成熟的DCs接受病原体相关分子模式(PAMPs)或危险信号刺激后分化成熟，成熟过程中DCs上调趋化因子受体7 (CCR7)表达，获得淋巴细胞归巢能力，DCs的成熟度决定其迀移能力。一旦到达淋巴结T细胞区，成熟DCs在表达于⑶4+T细胞表面的CD40L的刺激下“批准”后激活。CD40信号刺激，上调DCs表面共刺激分子，抗凋亡分子，上调IL-12的分泌，使DCs获得最佳激活⑶8+T细胞的能力。
[0004]过继性细胞免疫治疗主要是通过给患者回输各种特异性与非特异性的免疫效应细胞发挥对患病细胞的杀伤作用，同时调节和增强机体的免疫功能，往往用于患者放、化疗或造血干细胞移植、器官移植后的辅助治疗上。因此，过继性树突状细胞输注作为日趋成熟的免疫疗法在肿瘤和慢性感染性疾病的防治中发挥越来越大的作用。
[0005]过继性DCs需经过抗原负载和活化成熟两个功能化阶段才可成为功能化的DCs疫苗。培养环境中的散在抗原可以通过胞饮作用一定程度地被过继性DCs摄取，这也是临床过继性DCs治疗过程中常用的抗原负载方法。这种粗放性的抗原负载方法虽然操作简便，但由于过继性DCs培养微环境中的较低的抗原丰度和抗原经胞饮途径本身的代谢特点使得DCs抗原负载效率大打折扣。影响过继性DCs功能化的另一关键因素是过继性DCs的激活和成熟程度。成熟的过继性DCs通过其表面表达的多种共刺激分子(如CD40，CD80, CD86等)和Thl类细胞因子(IL-12P?，IL-1 β，TNF- α等)诱导T细胞免疫激活，而未成熟的过继性DCs不仅不能活化T细胞，反而会使T细胞功能失活，诱导T细胞耐受。
[0006]目前，经FDA认证的细胞因子鸡尾酒(Cytokine cocktail，包括细胞因子IL-1 β、TNF-α、IL-6和PGE2)和改良细胞因子鸡尾酒(包括细胞因子IL-1 β、TNF-α、IL_6、和polyl:C)是刺激过继性DCs成熟最常用的促进剂。该促进剂能够显著提高过继性DCs的成熟度，包括共刺激分子的上调表达和某些促炎因子的分泌。但是，该促进剂最大的缺陷是其不能有效地促进过继性DCs分泌IL-12，而大量的文献证明过继性DCs激活T细胞很大程度上依赖于其IL-12的高分泌，这也是近几年过继性DCs治疗在临床上响应率低下(10-15% )的主要原因。
[0007]因此，开发有效的促进剂，最大程度地提高过继性DCs的抗原负载效率及激活成熟程度，促进过继性DCs在体内迀移及递呈抗原给T细胞的能力，从而诱发机体强烈的免疫应答，是提尚其临床疗效的关键。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂，主要成分包括用免疫刺激剂和抗原分别修饰金纳米粒子得到的免疫刺激剂-纳米金复合物和抗原-纳米金复合物；或主要成分包括用免疫刺激剂和抗原联合修饰金纳米粒子得到的免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物；优选地，所述金纳米粒子为球形金纳米粒子、棒状金纳米粒子或立方体金纳米粒子。
[0009]所述球形金纳米粒子由以下方法制备得到:按体积份数，将100份的氯金酸溶液(0.01wt% )加热至110-130°C后迅速加入0.4-3.0份的柠檬酸钠溶液(lwt% )继续搅拌得到球形金纳米粒子胶体溶液，离心浓缩后即得到球形金纳米粒子；优选地，所述球形金纳米粒子的流体力学半径在10-90nm。
[0010]所述棒状金纳米粒子由以下方法制备得到:
[0011]1、按体积份数，将I份的氯金酸溶液(0.01mol/L)与30份的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，lOOmmol/L)溶液混合均匀后，加入2.4份新鲜配置、置于冰水浴中的硼氢化钠溶液(0.01mol/L)并倒置混匀，静置于25°C水浴中陈化l_5h，得到金纳米种子溶液；
[0012]I1、按体积份数，将40份的氯金酸溶液(0.01mol/L)、6份的硝酸银溶液(0.0lmol/L)和6.4份的抗坏血酸溶液(0.0ImoI/L)依次加入到950份的CTAB溶液(0.0ImoI/L)中，再加入1-10份步骤I得到的金纳米种子溶液，混匀，静置于25°C水浴中，陈化3h，得到棒状金纳米粒子胶体溶液，离心浓缩后即得到棒状金纳米粒子。
[0013]所述免疫刺激剂-纳米金复合物中金纳米粒子的粒径为15-80nm，优选60_80nm ；和/或金纳米粒子的含量为12.5 μ g/mL-37.5 μ g/mL，优选25 μ g/mL ;或
[0014]按以下方法制备得到:用还原剂对巯基化CpG序列(5 ’ -SH-AAAAA-Spacer9-tccatgacgttcctgacgtt_3’ )进行脱二硫键预处理，再对金纳米粒子进行功能化修饰；
[0015]优选地具体步骤如下:
[0016](I)、用pH = 8.0，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液将二硫苏糖醇(DTT)配制成浓度为0.1-0.2mol/L的DTT溶液，再加入0.25倍DTT溶液体积的CpG (100 μ mol/L)室温反应Ih后完成脱二硫键，然后进行除杂；所述除杂是用核酸纯化柱进行；
[0017](2)、将步骤(I)得到的除杂处理后的反应液与金纳米粒子混合，使CpG的终浓度为3-5 μ mol/L，室温振荡24h得到免疫刺激剂-纳米金复合物:CpG_球形纳米金复合物。
[0018]所述抗原-纳米金复合物中金纳米粒子的粒径为15-80nm，优选40_80nm ;和/或金纳米粒子的含量为12.5 μ g/mL-37.5 μ g/mL,优选25 μ g/mL ;或
[0019]按以下方法制备得到:抗原与金纳米粒子的偶联；
[0020]优选的具体步骤如下:
[0021]将经修饰的抗原与金纳米粒子混合至经修饰的抗原的终浓度为50-500 μ mol/L,室温下振荡孵育24h，得到抗原-纳米金复合物；
[0022]例如:当抗原为OVAp时，制备抗原-纳米金复合物的具体步骤为:首先将巯基化聚乙二醇(SH-PEG)与金纳米粒子混合至SH-PEG的终浓度为lmg/mL，室温共孵育约0.5h，然后加入OVAp至OVAp的终浓度为50 μ mol/L,室温振荡24h，得到OVAp-纳米金复合物备用；或
[0023]当抗原为mAGE-1时，制备抗原-纳米金复合物的具体步骤为:构建重组质粒，体外纯化获得mAGE-1 ;将mAGE-1与金纳米粒子混合至mAGE-1的终浓度为1-1Omol，并室温保持lh，得到抗原-纳米金复合物:mAGE-l-纳米金复合物备用。
[0024]所述免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物是按以下方法制备得到:将所述免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联得到；优选的具体步骤如下:将一定剂量(如终浓度50-500 μ mol/L)的抗原与免疫刺激剂-纳米金复合物等体积混合，室温下振荡孵育24h后3000-12000rpm转速离心10-20分钟，即得到免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物。
[0025]将所述免疫刺激剂-纳米金复合物与所述抗原-纳米金复合物按体积比(1-3):(3-1)混合均匀即得；优选地，金纳米粒子在促进剂中的含量为25-100 μ g/mL，更优选金纳米粒子在促进剂中的含量为25-75 μ g/mL,最优选金纳米粒子在促进剂中的含量为50 μ g/mLo
[0026]本发明的第二个目的在于提供制备上述促进剂的方法，用以下方法之一:
[0027]方法一包括:
[0028]①制备金纳米粒子；
[0029]②制备免疫刺激剂-纳米金复合物和制备抗原-纳米金复合物；
[0030]③促进剂纳米金鸡尾酒的调配:再将免疫刺激剂-纳米金复合物和抗原-纳米金复合物按体积比(1-3):(3-1)混合均匀即得；
[0031]方法二包括:
[0032]①制备金纳米粒子；
[0033]②制备免疫刺激剂-纳米金复合物；
[0034]③免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联，即得。
[0035]具体的步骤为:
[0036]所述方法一和方法二中步骤①制备金纳米粒子的具体步骤为:
[0037]球形金纳米粒子的制备:按体积份数，将100份的氯金酸溶液(0.0lwt% )加热至110-130°C后与0.4-3.0份的柠檬酸钠溶液(lwt% )混合，离心、浓缩得到球形金纳米粒子；优选地，所述球形金纳米粒子的流体力学半径在10-90nm ;或
[0038]棒状金纳米粒子的制备:1、按体积份数，将I份的氯金酸溶液(0.0lmol/L)与30份的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，lOOmmol/L)溶液混合，再与2.4冰的硼氢化钠溶液(0.01mol/L)混匀，静置于25°C水浴中陈化l_5h，得到金纳米种子溶液；I1、按体积份数，将40份的氯金酸溶液(0.0ImoI/L)、6份的硝酸银溶液(0.0ImoI/L