一种开发fus蛋白病药物新靶点的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种用于开发FUS蛋白病(FUSprοte inopathi es )诊断手段及治疗药物的新革巴点。
【背景技术】
[0002]FUS蛋白病(FUS proteinopathies),是一组致命性的、累及多种神经元包括运动神经元的神经退行性疾病。铜/锌超氧化物歧化酶I (Cu/Zn SODl)基因在家族性ALS患者中发生突变，是第一个被鉴定出的ALS相关基因。接下来又发现了 10多个与ALS有关联的基因，其中包括RNA/DNA结合蛋白TDP-43和FUS。FUS即肉瘤融合蛋白(fused insarcoma)ο许多神经系统疾病检测到具有FUS免疫阳性的包涵体，因此从病理角度讲，这些疾病可以归类为FUS蛋白病。这些疾病在遗传上和临床上都是异质性的。根据累及的区域不同，FUS蛋白病可以表现为运动神经元疾病(如ALS-FUS)、额颞叶变性病(FTLD-FUS)、非典型FTLD-泛素病理(aFTLD-U)、神经元中间丝包涵体病(NIFID)和嗜碱性包涵体病。有意思的是，尽管在ALS-FUS患者中发现了 30多个FUS基因突变，但是在绝大多数散发性或家族性FTLD-FUS病例中还没有检测到任何FUS本身的基因突变。最近，在ALS-FUS患者的FUS基因3’非翻译区鉴定出几个与FUS表达增加有关的突变，提示FUS表达的增加可能是FUS蛋白病的一种发病机制。
[0003]有几个模型被用来模拟FUS蛋白病，这些模型包括从单细胞的酵母到多细胞的果蝇及脊椎动物。包括Lanson及其同事和我们团队在内的几个研究组建立了表达人源FUS蛋白野生型和ALS突变型的转基因果蝇。在我们的果蝇模型中，野生型或ALS突变型的FUS蛋白在特定亚群神经元细胞中的表达导致年龄依赖的神经退化和功能缺失，表现出FUS蛋白病的典型特征。在大鼠转基因模型中，野生型FUS的过表达即可导致神经细胞的逐渐衰退。虽然FTLD-FUS患者FUS基因没有发生突变，但是却检测到FUS蛋白水平的上升，所以野生型FUS表达的上升有助于我们理解FTLD-FUS ;而FUS的突变如P525L则与ALS-FUS密切相关。
[0004]为了弄清哺乳动物FUS蛋白在神经系统中的生物功能，我们研究了与FUS相互作用的蛋白。使用FUS特异性单克隆抗体，我们发展了一种免疫纯化与质谱技术联合使用的方法，在脑组织中鉴定出包括HSP60在内的几个线粒体蛋白是与FUS相互作用的候选蛋白。单纯用质谱方法也在纯化的线粒体中检测到了 FUS蛋白，进一步支持FUS与线粒体可能存在相互作用的推测。这些结果促使我们利用FUS蛋白病模型详细检查线粒体的变化。
[0005]HSP60蛋白属于进化上保守并依赖于ATP的分子伴侣家族，在应激反应、蛋白质折叠和细胞信号转导中起重要作用。HSP60存在于细胞质和线粒体基质中，既组成型表达，也受胁迫信号诱导表达。据报道，HSP60与HSP10、HSP70等其他热激蛋白一起，促进蛋白质复合体的正确折叠和装配并运输至线粒体中。Typel3痉挛性截瘫(SPG13)是一种晚发型常染色体显性遗传的神经退行性疾病，其特征是进行性衰弱和下肢痉挛，研究发现这种疾病患者的HSP60基因，即HSHH，存在基因突变。
[0006]ALS中的线粒体损伤已有广泛研究，特别是在SODl动物模型中。过表达TDP-43的转基因小鼠，在其运动神经元中观察到线粒体发生聚集。两例ALS-FUS患者的脊髓样本(其中一例携带P525L突变)切片的电子显微镜研究显示，细胞内的线粒体和内质网变得杂乱不规则。另外两个与ALS有关的FUS突变体(R521G或R521H)在胞质中异常定位，研究发现与体外培养的运动神经元的线粒体发生缩短有关。这些研究说明线粒体损伤可能是ALS-FUS的共同特征。但是，有关FUS的线粒体定位和FTLD-FUS患者神经细胞线粒体损伤仍然没有报道。尽管FUS的表达直接造成线粒体损伤有待进一步确定，但是我们的研究数据显示，线粒体的片段化不仅在体外培养的神经元细胞中发生，在FUS转基因果蝇的运动神经元中也存在。野生型FUS(Wt-FUS)和ALS突变型FUS(P525L-FUS)都与HSP60相互作用。我们在FTLD-FUS患者的脑组织样本中检测到线粒体损伤，且FUS的蛋白水平上升。出乎意料的是，在其中两个样本中检测到HSP60表达上升。使用RNAi技术沉默培养细胞中的HSP60，则导致线粒体中FUS的水平下降。有意思的是，RNAi调节的HSP60同源物的下调，在一定程度上缓解FUS转基因果蝇的神经退行性表型。因此，FUS表达的增加和线粒体的损伤可能是FTLD-FUS的显著病理特征。我们的实验数据还揭示了一种以前未被发现的FUS调节方式，即分子伴侣蛋白HSP60调节FUS的亚细胞定位。我们的研究结果说明，通过调节FUS的线粒体定位是治疗FUS蛋白病、防止FUS诱发线粒体损伤的一条途径。
【发明内容】
[0007]本发明主要解决的技术问题是提供一种用于开发FUS蛋白病(FUSprοte inopathi es)诊断手段及治疗药物的新革巴点。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种用于开发FUS蛋白病(FUS proteinopathies)诊断手段及治疗药物的新靶点，包括FUS蛋白、HSP60蛋白及FUS蛋白和HSP60蛋白之间的相互作用。
[0009]在本发明一个较佳实施例中，所述FUS蛋白野生型和突变型的序列分别为SeqN0.1及2，所述HSP60蛋白的序列为Seq N0.3。
[0010]在本发明一个较佳实施例中，在FUS蛋白病(FUS proteinopathies)中表现为FUS免疫信号增加，FUS表达量上升，线粒体出现损伤或损伤加重；在体内过表达Wt-或P525L-突变型FUS蛋白，导致线粒体缺陷。
[0011]在本发明一个较佳实施例中，所述FUS蛋白和所述HSP60蛋白之间的相互作用是在胞质中和线粒体上发生的；所述FUS蛋白和所述HSP60蛋白之间的相互作用为直接相互作用；所述HSP60蛋白对所述FUS蛋白在线粒体上的定位有调节作用。
[0012]在本发明一个较佳实施例中，所述HSP60蛋白与所述FUS蛋白之间的相互作用使得FUS富集和定位到线粒体上，引发线粒体膜电位降低和活性氧升高，神经细胞的线粒体出现碎片化并引发神经退行性疾病的发生。
[0013]在本发明一个较佳实施例中，以所述新靶点开发的诊断手段及治疗药物能用于诊断、预防和治疗FUS蛋白病(FUS proteinopathies)。
[0014]在本发明一个较佳实施例中，所述药物为小分子化合物、FUS蛋白抗体、HSP60蛋白抗体、融合蛋白或基因药物。
[0015]在本发明一个较佳实施例中，所述药物能与FUS蛋白或HSP60蛋白结合、降低或阻断FUS蛋白与HSP60蛋白之间的相互作用，或者降低FUS基因和HSP60基因的表达。
[0016]在本发明一个较佳实施例中，所述药物包括siHSP60，所述siHSP60是以HSP60蛋白为对象，合成抑制HSP60基因表达的小RNA片段RNA1:siHSP60。
[0017]在本发明一个较佳实施例中，所述siHSP60的序列为Seq N0.4。
[0018]本发明的有益效果是:本发明发现在多种FUS蛋白病(FUS proteinopathies)患者脑组织中FUS蛋白高表达，HSP60蛋白可以和FUS蛋白相互作用，从而可以调节FUS的线粒体定位，引发线粒体碎片化或损伤，进而发生神经退行性疾病，如非肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS-FUS)及 FTLD-FUS 等 FUS 蛋白病(FUSproteinopathies)ο
[0019]本发明提供的数据显示，在FUS蛋白病(FUS proteinopathies)患者中FUS表达量上升和线粒体出现损伤；并且FUS基因突变易导致FUS蛋白表达量升高，该蛋白与HSP60蛋白相互作用后定位于线粒体，导致线粒体损伤，进而导致FUS蛋白病(FUSproteinopathies)的发生。以该FUS蛋白或HSP60蛋白为靶点可以开发FUS蛋白病(FUSproteinopathies)的诊断手段及治疗药物。
【附图说明】
[0020]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中:
图1是本发明中在三例FUS蛋白病(FUS proteinopathies)患者样本组织中发现FUS蛋白表达升尚和线粒体损伤；
图2是本发明中HSP60蛋白可以与FUS蛋白相互作用，调节FUS蛋白在线粒体上的定位；
图3是本发明中提高野生型或突变型(P525UFUS基因在细胞中的表达，导致线粒体膜电位降低和线粒体活性氧增加；
图4是本发明中在小鼠原代皮层神经元细胞中和果蝇运动神经元细胞中表达野生型或突变型(P525L) FUS基因，导致细胞线粒体碎片化(mitochondrial fragmentat1n)等线粒体损伤表型；
图5是本发明中在哺乳动物细胞中表达野生型或突变型(P525UFUS基因，观察到FUS蛋白在线粒体上的定位并且导致细胞线粒体损伤；
图6是本发明中F