一种靶向治疗老年痴呆症的药物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医用制剂，更具体地讲，涉及一种治疗老年痴呆症的纳米制剂。
【背景技术】
[0002]老年痴呆症又称为阿尔茨海默病(AD)，是老年期痴呆中的最常见病因，以海马和皮质神经元大量、进行性丢失为特征，导致记忆力损害和认知功能障碍。β -淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ )分子量约 4kDa,由 β 淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursorprotein, APP)水解而来，由细胞分泌，在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用。A β的沉积不仅与神经元的退行性病变有关，而且可以激活一系列病理事件，包括星型胶质细胞和小胶质细胞的激活、血脑屏障的破环和微循环的变化等，是老年痴呆症病人脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因。由此可见如何减少Aβ的产生是治疗老年痴呆症的关键。BACEl和Y分泌酶是淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)降解产生A β的必要条件，正常情况下，存在于神经元细胞膜上的APP被a分泌酶和Y分泌酶的切割产生分泌型APP和C端片段(P3CT)。而对于老年痴呆症患者，APP被β分泌酶(BACEl)剪切形成C99片段，该片段进一步被Υ分泌酶剪切形成A β肽。研究显示小分子BACEl抑制剂、病毒包载的BACEl-siRNA均可成功减少A β产生、改善老年痴呆症模型症状。
[0003]但是对于小分子BACEl抑制剂存在难以预料到的副作用，例如严重视网膜病变。SiBACEl病毒载体存在安全性问题，非病毒载体干扰效率低下。因此，国内外尚无关于高通量SiBACEl载体用于老年痴呆症治疗的报道。
[0004]介孔氧化??圭纳米颗粒(MesoporousSilica Nanoparticles, MSNs),是一类具有有序排列的纳米孔结构的无机非金属材料。所谓“介孔”，是指孔径在2-50 nm之间的孔。特点如下:
(1)颗粒粒径大小:颗粒大小一般在50-300nm范围内。在此范围内的MSN可以被细胞有效内吞，同时表现出较小的细胞毒性；
(2)比较稳定的介孔结构:MSN由无机二氧化硅构成，与其他高分子纳米材料相比，具有一定刚性结构，以及在PH和温度条件下的相对不敏感性和稳定性；
(3)介孔尺寸:MSN的介孔直径在一定范围内进行调节(2-6nm)，在这一孔径范围内的MSN可以根据应用需求载带诸如DNA/RNA，蛋白质和其他药物分子，同时对药物释放的速率进行控制。
[0005]磁性介孔二氧化硅纳米复合材料(M-MSN)作为一种新型的纳米材料，具有比表面积大、表面可化学修饰性、独特的磁响应性、低毒性等特点。巨大的比表面积和孔体积可以用来储存和输送生物大分子，如核苷酸，超顺磁性可通过MRI进行药物示踪和显像。
【发明内容】
[0006]本发明的第一个目的在于，提供一种靶向治疗老年痴呆症的药物。
[0007]本发明的第二个目的在于，提供一种靶向治疗老年痴呆症的药物的制备方法。
[0008]本发明的第三个目的在于，提供一种靶向治疗老年痴呆症的药物载体。
[0009]本发明的第四个目的在于，提供PHI多肽修饰的磁介孔二氧化硅/siBACEl纳米复合物在制备靶向治疗老年痴呆症的药物中的应用。
[0010]本发明的第五个目的在于，提供PHI多肽修饰的磁介孔二氧化硅/siRNA纳米复合物在制备靶向治疗老年痴呆症的药物载体中的应用。
[0011]本发明的第六个目的在于，提供PHI多肽修饰的磁介孔二氧化硅/SiBACEl纳米复合物在制备老年痴呆症早期诊断磁共振增强显像剂中的应用。
[0012]为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案:一种靶向治疗老年痴呆症的药物，所述药物为PHI多肽修饰的磁介孔二氧化硅/siBACEl纳米复合物，所述PHI多肽为C-FRHMTEQ-C，所述siBACEl为BACE1_5，所述磁介孔二氧化硅/siBACEl纳米复合物以Fe3O4纳米晶体为核心，磁介孔结构为外壳，介孔内负载siBACEl，外壳表面包封PEI J^KALA肽及PHI修饰。
[0013]为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案:一种靶向治疗老年痴呆症的药物的制备方法，包括以下步骤:
(1)制备磁性介孔二氧化硅纳米粒子M-MSN；
(2)负载BACE1_5 ；
(3)制备M-MSN_BACE1@PEI ；
(4)制备M-MSN_BACE1@PE1-KALA/PHI。
[0014]作为一个优选方案，步骤(I)中M-MSN直径50nm，孔径3.6nm。
[0015]作为一个优选方案，步骤(4)制备M-MSN_BACE1@PE1-KALA/PHI包括以下步骤:
(1)将M-MSN_BACE1@PEI转运载体分散在无水乙醇中，向其中滴加SPDP乙醇溶液，涡旋后静置；
(2)对步骤(I)的产物进行离心，将分离后所得的颗粒产物在去离子水中重新分散，滴入KALA多肽水溶液，涡旋后静置，离心分离颗粒产物，检测上清溶液在343 nm处的紫外吸光值；
(3)将步骤(2)获得的颗粒重新分散于去离子水中，向溶液中滴入PHI环肽水溶液，涡旋后静置，离心分离颗粒产物，检测上清溶液在343nm处的紫外吸光值。
[0016]为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案:一种靶向治疗老年痴呆症的药物载体，所述载体为PHI多肽修饰的磁介孔二氧化硅/siRNA纳米复合物，所述PHI多肽为C-FRHMTEQ-C，所述磁介孔二氧化硅/siRNA纳米复合物以Fe3O4纳米晶体为核心，磁介孔结构为外壳，介孔内负载siRNA，外壳表面包封PEI，经KALA肽及PHI修饰。
[0017]为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案:PHI多肽修饰的磁介孔二氧化硅/siBACEl纳米复合物在制备靶向治疗老年痴呆症的药物中的应用，所述PHI多肽为C-FRHMTEQ-C,所述siBACEl为BACE1_5，所述磁介孔二氧化硅/siBACEl纳米复合物以Fe3O4纳米晶体为核心，磁介孔结构为外壳，介孔内负载siBACEl，外壳表面包封PEI，经KALA肽及PHI修饰。
[0018]为实现本发明第五个目的，本发明公开以下技术方案:PHI多肽修饰的磁介孔二氧化硅/siRNA纳米复合物在制备靶向治疗老年痴呆症的药物载体中的应用，所述PHI多肽为C-FRHMTEQ-C，所述磁介孔二氧化硅/siRNA纳米复合物以Fe3O4纳米晶体为核心，磁介孔结构为外壳，介孔内负载siRNA，外壳表面包封PEI，经KALA肽及PHI修饰。
[0019]为实现本发明第六个目的，本发明公开以下技术方案:PHI多肽修饰的磁介孔二氧化硅/siBACEl纳米复合物在制备老年痴呆症早期诊断磁共振增强显像剂中的应用。
[0020]本发明的优点在于:本发明提供的药物以siBACEl为有效成份，以PHI多肽为靶向头基，以高分子聚合物为载体，靶向阻止神经元BACEl的表达，达到抑制老年痴呆症病灶区的β淀粉样蛋白的产生和沉积，缓解老年痴呆症症状的目的。该纳米制剂可以将siBACEl靶向聚集于有Αβ沉积的神经细胞，而对于其它神经元及神经组织影响较小。由于超顺纳米磁粒子可通过作为磁共振显像，该药物还可以作为磁共振的增强显像剂用于老年痴呆症的早期诊断。本发明提供的制备方法简单易行，原料易得，制备过程重复性好，生物相容性闻。
【附图说明】
[0021]图1为通过动态光散射法(DLS)测量M-MSN_siRNA@PE1-KALA/PHI转运载体的水力学尺寸与Zeta电位,米用仪器为MalvernZetasizer Nano S90。
[0022]图2说明M-MSN_BACE1@PE1-KALA/PHI对于Neuro2细胞及大鼠神经原细胞均有良好的生物相容性。
[0023]图3 说明 M-MSN_siRNAOPE1-KALA/PHI 具有干扰 BACEl 表达的作用。
[0024]图4说明M-MSN_BACE1@PE1-PHI对于Αβ有靶向识别作用，左图显示F-M-MSN0PEI与Αβ无特异性结合，右图显示F-M-MSN0PE1-PHI与Αβ存在共定位。
[0025]图5说明M-MSN_BACE1@PE1-PHI可以通过MRI显影，上图为纳米复合物组的T2序列以及SWI序列平扫，注射MSN的部位呈现低信号，下图为生理盐水对照组T2序列平扫。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0027]实施例1.PHI多肽修饰的磁介孔二氧化硅/SiRNA纳米复合物的制备制备方法:
I)合成M-MSNs材料:
M-MSNs的合成:单分散的Fe3O4颗粒通过共沉淀的方法合成，产物用油酸(购自于国药集团化学试剂有限公司)稳定修饰后保存于氯仿溶液中。将氯仿中分散的磁性Fe3O4纳米颗粒通过结合表面活性剂十六烧基三甲基溴化铵(CTAB,购自于Sigma-Aldrich公司)后转入到水相环境中。通过滴加NaOH改变溶液的pH至碱性，再向其中加入TE0S，并提高反应温度至70°C，使二者在溶液中进行自组装。将产物分离水洗，而后在超声环境下用丙酮移除产物中CTAB模板。将移除模板后的产物进行干燥处理，最终得到黄色的粉末。
[0028]未除CTAB模板的M-MSNs合成方法:合成步骤与上述步骤完全一致，合成反应结束后将直接分离产物并用去离子水洗涤，并没有最后提取模板的步骤。
[0029]合成扩大孔径的M-MSNs:合成扩大孔径的M-MSNs的步骤与上述合成步骤基本类似，其不同之处在于将磁性Fe3O4纳米颗粒通过表面活性剂CTAB转入到水相环境后，迅速其中加入扩孔试剂均三甲基苯(TMB)或正癸烷(Decane)，反应一段时间后再向溶液中加入TEOS，合成材料。
[0030]2 ) M-MSNs 吸附 s i RNA:
M-MSNs对siRNA的装载:向离心管中加入0.25 mg M-MSNs与40 μ L乙醇，在水浴中超声使M-MSNs在溶液均匀分散。依次向混合溶液中加入10 yL