冻干的或可冻干形式的lkktet和/或lkktnt肽组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为200680021662. 0,申请日为2006年6月19日，发明名称为"冻 干的或可冻干形式的LKKTET和/或LKKTNT肽组合物"的中国专利申请的分案申请。
[0002] 发明背景
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本发明要求2005年6月17日提交的美国临时申请60/691，261和2006年2月28 日提交的美国临时申请60/776, 947的权益。
技术领域
[0005] 本发明涉及LKKTET和/或LKKTNT组合物及方法的领域。
【背景技术】
[0006] 胸腺素e 4起初被认为是在体外内皮细胞迀移和分化期间被上调的蛋白。胸腺素 0 4最初从胸腺分离，是一个具有43个氨基酸、4. 9KDa、在多种组织中普遍存在的多肽。归 于该蛋白的几种功能包括在内皮细胞分化和迀移、T细胞分化、肌动蛋白隔离、血管形成和 伤口愈合中的功能。
[0007] 已经鉴定了许多T0 4异构体，其与已知的T0 4氨基酸序列具有约70%、或约 75 %、或约80 %或更高的同源性。这些异构体包括，例如T 0 4ala、T 09、T01O、T011、T012、 Tf3 13、Tf3 14和Tf3 15。与Tf3 4相似，Tf3 10和Tf3 15异构体也表现出能隔离肌动蛋白的 活性。T 4、T 10和T 15,以及这些其他异构体共有一个氨基酸序列LKKTET或LKKTNT， 其似乎参与调节肌动蛋白的隔离或结合。尽管不希望被任何特定的理论所限制，但本文中 描述的肽试剂的活性至少部分地归因于这些试剂的抗炎活性。0 _胸腺素也调节了肌动蛋 白聚合（例如，0胸腺素似乎通过隔离游离的G-肌动蛋白而解聚F-肌动蛋白）。T 0 4调 节肌动蛋白聚合的能力可归因于其通过LKKTET序列结合或隔离肌动蛋白的能力。
[0008] 本领域需要LKKTET和/或LKKTNT的组合物和方法。
【发明内容】
[0009] 根据一个【具体实施方式】，组合物包括含氨基酸序列LKKTET或LKKTNT或其保守变 异体的肽试剂，或者包括刺激LKKTET或LKKTNT肽或其保守变异体产生的刺激试剂，该组合 物包括至少一种氨酸稳定剂，该组合物是冻干的形式或能够被冻干的形式。
[0010] 根据另一【具体实施方式】，组合物包括含氨基酸序列LKKTET或LKKTNT或其保守变 异体的肽试剂，或者刺激LKKTET或LKKTNT肽或其保守变异体产生的刺激试剂，以及包括冻 干填充剂或氨基酸稳定剂中的至少一种，所述组合物是冻干的形式。
【具体实施方式】
[0011] 为多种目的而对受试者施用的许多组合物含有一种或多种可能导致受试者损伤 的组分。
[0012]例如，防腐剂，如用在许多眼用和化妆产品的苯扎氯铵（BAK)，在施用该产品时可 引起表面刺激和/或伤害。综合症包括发红和不适。
[0013] 长期使用含有季铵盐（如BAK)的滴眼液会产生显著且逐渐严重的眼睛表面刺激 和细胞凋亡。患者经常发展为诸如发红和通常的眼部不适这样的症状。本发明的肽试剂， 例如胸腺素0 4 (T 0 4)，在与季铵盐（如BAK) -起接触眼组织对受试者施用时，可用于治疗 或阻止对眼组织的伤害或受损。
[0014] 可以用于本发明的季铵盐的实例包括BAK、西曲溴铵（cetrimide)、苯佐氯铵 (benzoxonium)及其类似物。
[0015] 根据【具体实施方式】，该肽试剂与作为同一个制剂一部分的铵盐如BAK -起施用， 例如作为添加剂加入到含BAK或其他季铵盐的制剂中。季铵盐如BAK在许多眼溶液，如青 光眼滴眼液中常用作防腐剂。
[0016] 在另一个【具体实施方式】中，该肽试剂可在施用季铵盐如BAK之前，和/或施用季铵 盐如BAK期间，和/或施用季铵盐如BAK之后施用。
[0017] 根据【具体实施方式】，本发明尤其可用于阻止对眼角膜上皮的眼组织的伤害，其包 括阻止这类眼组织中的细胞凋亡。例如，本发明也用作抗青光滴眼液或其他滴眼液的佐剂。
[0018] 本发明一方面提供了眼用组合物，其包括含氨基酸序列LKKTET或LKKTNT的肽试 剂或其保守变异体。
[0019] 本发明另一方面提供了治疗眼组织的方法，其包括对所述眼组织局部施用眼用组 合物，该组合物包括氨基酸序列LKKTET或LKKTNT的肽试剂或其保守变异体
[0020] 在【具体实施方式】中，本发明提供了通过将眼组织与有效量的含本文描述的肽试剂 的组合物接触的治疗方法。直接施用的实施例包括，例如直接应用含本文描述的肽制剂的 溶液、洗剂、油膏、凝胶、乳膏、糊剂、喷雾剂、悬浮液、分散液、水凝胶、软膏、油或泡沫与组织 接触。
[0021] 未发现适于任何特定理论，肌动蛋白-隔离肽，如胸腺素P4(T04或TB4)和其他 包括肌动蛋白-隔离肽或肽片段的试剂可以促进眼组织健康，其中肌动蛋白-隔离肽或肽 片段含氨基酸序列LKKTET或LKKTNT或其保守变异体。
[0022] 胸腺素0 4起初被认为是内皮细胞迀移和体外分化期间被上调的蛋白。胸腺素 0 4最初从胸腺分离，是一个具有43个氨基酸、4. 9Kda、在多种组织中普遍存在的多肽。归 于该蛋白的几种功能包括在内皮细胞分化和迀移、T细胞分化、肌动蛋白隔离、血管形成和 伤口愈合中的功能。
[0023] 根据【具体实施方式】，本发明优选地适用于胸腺素0 4、和/或TP 4异构体、类似物 或衍生物，其中包括KLKKTET、LKKTETQ、氧化的T 0 4、T 0 4亚砜、T 0 4的N-端变异体和C-端 变异体。
[0024] 根据【具体实施方式】，可用于本发明的组合物包括肽试剂，例如胸腺素0 4、和/或 T 0 4异构体、类似物或衍生物，其中包括T 0 4的氧化形式（包括T 0 4亚砜）、T 0 4的N-端 变异体和C-端变异体、以及包含或基本上由氨基酸序列LKKTET及其保守性变异体组成的 多肽或肽片段。国际申请PCT/US99/17282公开了可用于本发明的TP 4的异构体，以及可 用于本发明的氨基酸序列LKKTET或LKKTNT和其保守变异体，该申请通过引用的方式纳入 本文。国际申请PCT/GB99/00833(W099/49883)公开了可用于本发明的氧化的胸腺素0 4， 该申请通过引用的方式纳入本文。尽管本发明在下文中主要针对T 0 4和T 0 4异构体进 行描述，但应当理解为以下描述同样适用于氨基酸序列LKKTET或LKKTNT、包含或基本上由 LKKTET、LKKTNT组成的肽和片段、它们的保守变异体，和/或T 0 4异构体、类似物或衍生物， 其中包括氧化的T 0 4、T 0 4的N-端变异体和C-端变异体。
[0025] 根据【具体实施方式】，本发明的组合物以每天、每两天、每两周、每两个月等的频率 施用，其中在施用的每日，可进行单次或多次用药，例如每施用当日用药2、3、4或更多次。
[0026] 已经鉴定了许多T0 4异构体，其与已知的T0 4氨基酸序列具有约70%、或约 75 %、或约80 %或更高的同源性。这些异构体包括，例如T 0 4ala、T 09、T01O、T011、T012、 Tf3 13、Tf3 14和Tf3 15。与Tf3 4相似，异构体Tf3 10和Tf3 15也表现出能隔离肌动蛋白的 活性。T 4、T 10和T 15,以及其他异构体共有氨基酸序列LKKTET或LKKTNT，其似乎参 与调节肌动蛋白的隔离或结合。T 0 4具有抗炎活性，并且也能调节肌动蛋白聚合（例如，0 胸腺素似乎通过隔离游离的G-肌动蛋白而解聚F-肌动蛋白）。TP 4调节肌动蛋白聚合的 能力可归因于其通过LKKTET或LKKTNT序列结合或隔离肌动蛋白的能力。这样，与T 0 4 - 样，其他抗炎性蛋白和/或结合或隔离肌动蛋白，或者调节肌动蛋白聚合的蛋白（其中包括 具有氨基酸序列LKKTET的T 0 4异构体）很可能如本文说明的那样单独或与T 0 4组合而 发挥作用。
[0027] 因此，可以明确预期已知的T0 4异构体，例如TP 4ala、T0 9、T0 10、TP 11、T0 12、 Tf3 13、TM4和Tf3 15,以及还未鉴定的Tf3 4异构体可用于本发明的方法。这样，Tf3 4异 构体可用于本发明的方法，其中包括在受试者中采用的方法。本发明从而进一步提供了包 括1'0 4，以及1'0 4异构体1'0 4-、1'0 9、1'0 1〇、1'0 11、1'0 12、1'0 13、1'0 14和1'0 15，以及 眼用载体的药物组合物。
[0028] 另外，如在适当的隔离、结合、动员或聚合分析中所显示的那样或如通过具有调节 肌动蛋白结合的氨基酸序列（例如LKKTETR、LKKTNT)所确认的那样，其他具有抗炎活性和 /或肌动蛋白隔离或结合能力，或能够动员肌动蛋白或调节肌动蛋白聚合的试剂或蛋白质， 可相似地用于本发明的方法。这样的蛋白包括例如凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白（DBP)、 抑制蛋白（profilin)、cofilin、蚕食蛋白（depactin)、DNA酶I、绒毛蛋白（villin)、截断 蛋白（fragmin)、肌割蛋白（severin)、加帽蛋白（capping protein)、肌动蛋白和肌动 调解蛋白（acumentin)。因此，方法包括已用于受试者的那些方法。本发明进一步提供了药 物组合物，其包括本文提到的凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白（DBP)、抑制蛋白（profilin)、 cofilin、蚕食蛋白（depactin)、DNA酶I、绒毛蛋白（villin)、截断蛋白（fragmin)、肌割蛋 白（severin)、加帽蛋白（capping protein)、肌动蛋白和肌动调解蛋白（acumentin)。 因此，本发明包括含有氨基酸序列LKKTET、或LKKTNT和其保守变异体的多肽的应用。
[0029] 本文所使用的术语"保守变异体"或其语法上的变体是指氨基酸残基被另一种生 物学上相似的残基替换。保守变异体的实例包括疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或 甲硫氨酸替换另一个疏水性残基，极性残基替换另一个极性残基，例如用精氨酸替换赖氨 酸、谷氨酸替换天门冬氨酸、或谷氨酰胺替换天门冬酰胺以及类似的替换。
[0030] 根据【具体实施方式】，本发明的组合物是滴眼液制剂。
[0031] 根据【具体实施方式】，用于本发明的组合物包含本文所描述的肽试剂，其中肽试剂 的浓度范围是大约〇. 001-1000毫克每毫升（mcg/ml)，更优选的是0. l-100mcg/ml，最优选 的是大约l-l〇mcg/ml。在特别优选的【具体实施方式】中，该肽试剂是T0 4。
[0032] 根据【具体实施方式】，本发明用于治疗或预防眼组织由于与季铵盐如BAK接 触造成的损害或损伤，季铵盐浓度范围是大约0. 0001 -1w t %，优选的浓度范围是大约 0. 001-0. lwt %，更优选的浓度范围是0. 002-0. 05wt %。在一个【具体实施方式】中，季铵盐的 浓度是大约〇? 005-0. 02wt%。
[0033] 根据【具体实施方式】，本发明也包括含本文中所描述的肽试剂的药物组合物，该肽 试剂在可眼用载体中。这样的载体包括，例如本文中所列的载体。
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