肿瘤血管特异性趋化ctl纳米系统及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域中肿瘤血管特异性趋化CTL纳米系统及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一。肿瘤抗原特异性细胞毒性的T淋巴细 胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)过继疗法一直是肿瘤免疫治疗的研究热点和难点之一。 多年来对肿瘤特异性CTL过继治疗的研究往往在细胞实验中取得良好的效果，但是动物实 验或临床疗效欠佳。重要的原因就是体内能够靶向到肿瘤部位的肿瘤特异性CTL的细胞数 量有限，且由于免疫逃逸机制，到达肿瘤部位的特异性CTL靶向识别和杀伤肿瘤细胞的生 物活性受到较大抑制，难以高效彻底地清除肿瘤细胞。因此为了使过继的CTL能够更有效 地靶向肿瘤细胞并提高其在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞的生物活性必须寻找新的有效方法。
[0003] IP-10是属于CXC类的趋化因子，不但具有抗肿瘤血管作用，而且可以定向募集T 淋巴细胞并促进其活化和增殖，引起肿瘤内淋巴细胞浸润，显示出强大的抗肿瘤潜力。而 IP-10靶向募集足够量的肿瘤特异性CTL到肿瘤部位的前提是肿瘤微环境中（而非仅仅 IP-10肿瘤局部注射部位）要有足够浓度的IP-10。目前主要通过转基因技术或者直接肿 瘤局部多点注射等方法使肿瘤富集IP-10,前者存在靶向性问题，后者仅能提高注射部位的 浓度。
[0004] 肿瘤血管生成对大多数实体瘤的生长和转移具有重要意义，肿瘤细胞诱导的新生 血管结构存在缺陷，分布方式无序，也无完整的微循环功能，与宿主正常组织的血管存在较 大差异，属于未分化成熟的血管。泛血管内皮标记因子相比有⑶31、⑶34、W因子相关抗原 等，Endoglin/CD105是新生血管的标志物。
[0005] 核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)从合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中 筛选并富集的对某些靶点具有高特异性和高结合率的小分子DNA或RNA片段。本实验室前 期工作中已筛选出能够特异与小鼠血管内皮细胞表面CD105分子的结合并具有高亲和力 的适配体，命名为Endoglin-Aptamer。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤并提高肿瘤药物对肿瘤的靶向性。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了基因传递系统（ENG-Apt/IP-10-LPs)，也 叫肿瘤血管特异性趋化CTL纳米系统，其名称为基因传递系统1。
[0008] 本发明所提供的基因传递系统，为基因传递系统1，是由核心和外壳组成的纳米粒 子；
[0009] 所述外壳由适配体、交联剂和纳米脂质体组成；
[0010] 所述适配体的序列如SEQ ID No. 1所示，其名称为Endoglin-Aptamer (ENG-Apt);
[0011] 所述适配体通过所述交联剂与所述纳米脂质体连接；
[0012] 所述核心为IP-10,所述IP-10为下述B1)或B2)的蛋白质：
[0013] B1)氨基酸序列为SEQ ID No. 2的蛋白质；
[0014] B2)在SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质。
[0015] 上述B2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述B2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No. 3所示的DNA序列中缺失一个或几个 氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或 3'端连上标签序列得到。
[0016] 上述基因传递系统1中，所述交联剂可为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺 (DSPE-PEG 2。。。-Mai)。所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺可为美国AVANTI公司产 品。
[0017] 上述基因传递系统1中，所述纳米脂质体由磷脂双分子层制成。
[0018] 上述基因传递系统1中，可在所述IP-10的N端和/或C端连上常用标签的氨基 酸序列。
[0019] 上述基因传递系统1中，所述常用标签可为His、Myc或His-Myc标签。
[0020] 上述基因传递系统1中，所述适配体、所述IP-10和所述纳米脂质体的摩尔比为1 : 3:15。所述纳米脂质体可含有有所述交联剂。
[0021] 为解决上述技术问题，本发明还提供了基因传递系统2。
[0022] 本发明所提供的基因传递系统2,也叫肿瘤血管特异性趋化CTL纳米系统，是由 与所述IP-10相关的生物材料和所述外壳组成的纳米粒子；所述生物材料包裹于所述外壳 中。
[0023] 上述基因传递系统2中，所述生物材料下述为C1)至C16)中的任一种：
[0024] C1)编码所述IP-10的核酸分子；
[0025] C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
[0026] C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
[0027] C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
[0028] C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
[0029] C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
[0030] C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
[0031] C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物；
[0032] C9)含有C1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
[0033] C10)含有C2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
[0034] C11)含有C3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0035] C12)含有C4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0036] C13)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0037] C14)含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0038] C15)含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0039] C16)含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0040] 其中，C5)至C8)所述的重组微生物均为胞外分泌所述IP-10的重组微生物。
[0041] 上述基因传递系统2中，C2)所述的含有编码所述IP-10的核酸分子的表达盒，不 但可包括启动IP-10基因转录的启动子，还可包括终止IP-10基因转录的终止子。进一步， 所述表达盒还可包括增强子序列。
[0042] 可用现有的表达载体构建含有所述IP-10基因表达盒的重组载体。
[0043] 上述基因传递系统2中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0044] 上述基因传递系统2中，C1)所述核酸分子为如下B11)或B21)或B31)所示的核 酸分子：
[0045] B11)序列表中SEQ ID No. 3所示的DNA分子；
[0046] B21)与B11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述IP-10 的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0047] B31)在严格条件下与B11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述IP-10的cDNA分 子或基因组DNA分子。
[0048] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQ ID No. 3的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95% 或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软 件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用来评价相关序列之间 的同一 ,性。
[0049] 上述基因传递系统2中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C 下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2 次，每次15min。
[0050] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0051] 上述基因传递系统2中，可在C1)所述核酸分子的5'端和/或3'端连上常用标 签的编码序列。
[0052] 上述基因传递系统2中，所述适配体、所述质粒和所述纳米脂质体的摩尔比为1 : 3 ：15〇
[0053] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述基因传递系统的制备方法。
[0054] 本发明所提供的所述基因传递系统的制备方法，包括用所述外壳包被所述核心或 所述生物材料，得到所述系统。
[0055] 上述方法中，所述方法还包括所述外壳的制备；
[0056] 所述外壳的制备包括：制备PEG修饰的纳米脂质体；用所述适配体修饰所述PEG 修饰的纳米脂质体得到所述外壳。
[0057] 上述方法中，所述PEG修饰的纳米脂质体的制备法可包括：用？0?(：(11311]1；[1:071- 2-0leoyl-sn-glycero_3-phosphocholine)、cholesterol、PEG2000_DSPE(l，2-distearoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000])、磷月旨酉先 乙醇胺-聚乙