包含含有大量活性成分的从东北婆婆纳中分离的纯化提取物或从此分离的化合物作为用 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种组合物及其用途，所述组合物包含含有大量活性成分的从东北婆 婆纳（Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum)中分离的纯化提取物或从此分离 的化合物作为用于预防或治疗慢性阻塞性肺病的活性成分。
【背景技术】
[0002] 通常，慢性阻塞性肺病（C0PD)是由导致呼吸道阻塞的肺的异常炎性疾病引起的 肺病之一。coro导致由排出气流阻碍引起的呼吸困难并显示出与哮喘的常见特征不同的特 征，例如，气道限制或气道阻塞的不良可逆性，根据经过时间的逐步发展等，并且，可以分成 肺气肿和慢性阻塞性支气管炎（Barnes P.J. 20014, Mediators of chronic obstructive pulmonary disease, Pharmacol. Rev. 56:515-548)〇
[0003] C0PD已经被报道为2011年世界范围心血管发病率和死亡率的危险因素之一和 第五主要死亡原因。基于慢性阻塞性肺病（C0PD)标准（FEV1和FVC的比小于0.7)的全 球倡议的慢性阻塞性肺病的患病率在45岁以上的韩国人中是17. 2% (男性，25. 8% ;女 性，9. 6%) (Dong Soon Kim, Young Sam Kim, Ki-Suck Jung, Jung Hyun Chang, Chae-Man Lim，Jae Ho Lee，Soo_Taek Uh，Jae Jeong Shim 和 Woo Jin Lew,代表韩国肺结核与呼吸 道疾病石开究院（Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Diseases), Am J Respir Crit Care Med Vol 172.pp 842-847,2005 ;Don D.Sin 和 S.F. Paul Man, Chronic Obstructive Pulmonary Disease as a Risk Factor for Cardiovascular Morbidity and Mortality, Proc Am Thorac Soc Vol2. pp 8-11, 2005 ；A Sonia Buist, Mary Ann McBurnie, William M Vollmer, Suzanne Gillespie, Peter Burney, David M Mannino, Ana M B Menezes, Sean D Sullivan,Todd A Lee, Kevin B Weiss, Robert L Jensen, Guy B Marks, Amund Gulsvik,Ewa Nizankowska-Mogilnicka, International variation in the prevalence of C0PD (The BOLD Study):a population-based prevalence study, Lancet, Vol 370 ;741-750, 2007 年 9 月 1 日）
[0004] 患有coro的大多数患者具有全部三种病理学机制（慢性阻塞性支气管炎、肺气肿 和粘液性阻塞）因为全部由吸烟诱导，但是他们可在肺气肿和阻塞性支气管炎的比例方面 不同。在发达国家，吸烟是coro的最常见的起因，但是有一些其他危险因素，包括空气污染 (尤其是，来自燃烧燃料的室内空气污染）、不良饮食和职业性暴露。coro以随年龄的增长 可见的肺功能正常下降的加快为特征。缓慢发展的气流限制导致残疾和早产儿死亡，并且， 与可变气道阻塞和很少发展为严重程度的哮喘的症状完全不同。
[0005] 已经报道的是，C0PD的病理生理活动和症状与哮喘的病理生理活动和症状根本不 同。尽管coro和哮喘两者与呼吸道的炎症有关，但是就发炎过程的本质而言有显著差异， 具有炎性细胞、介体、炎症反应、结构分布和抗炎症治疗反应的不同，例如，（a)对于炎性细 胞，肥大细胞、嗜酸性粒细胞、D4+细胞（Th2)、巨噬细胞等主要作用于哮喘的发生，而嗜中 性粒细胞、⑶8+(Tc)等主要作用于CCPD的发生；(b)对于炎性介体，白三烯B、组胺、IL-4、 IL-5、I1-13、嗜酸性粒细胞趋化因子、RENTES、氧化应激等主要涉及哮喘的发生，而TNF-a、 IL-8、GRO-ct等主要涉及C0PD的发生；（c)对于发炎症状，哮喘因在早期作用于总肺气管 而显示出的发炎症状（如AHR(气道高反应性）、上皮脱落、纤维化、无软组织参与、粘液分 泌、相对可逆的气道阻塞、咳嗽、打喷嚏、呼吸困难等）与通过作用于成人的外周气道发生 并且显示出各种现象（如上皮化生、实质破坏、相对可逆的气道阻塞、慢性支气管炎、肺气 肿等）的 C0PD 的发炎症状不同（Barnes PJ(2000b)Mechanisms in COPD:differences from asthma. Chest 117 (Suppl):10S-14S. ；Saetta M，Turato G, Maestrelli P，Mapp CE 和Fabbri LM(2001)Cellular and structural bases of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163:1304-1309) 〇
[0006] C0PD的组织病理学研究显示出外周气道（细支气管）和肺实质的主要参与， 而哮喘包括所有气道的炎症而不包括肺实质。随纤维化和巨噬细胞和T淋巴细胞的渗 透，有细支气管阻塞。既存在肺实质的破坏也存在巨噬细胞和CD8(细胞毒素的）T淋 巴细胞数的增加（Saetta M，Di Stefano A，Turato G，Facchini FM，Corbino L，Mapp CE，Maestrelli P,Ciaccia A 和 Fabbri LM(1998)CD8T-lymphocytes in peripheral airways of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:822-826.)。支气管的活组织检查显示出在患有严重C(PD的患者中具 有巨噬细胞和⑶8细胞的渗透和嗜中性粒细胞数增加的相似变化（Di Stefano A，Capelli A，Lusuardi M，Balbo P，Vecchio C，Maestrelli P，Mapp CE，Fabbri LM，Donner CF 和 Saetta M(1998)Severity of airflow limitation is associated with severity of airway inflammation in smokers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158:1277-1285.) 〇
[0007] 不同于哮喘，除了在恶化期间或当患者具有伴发性哮喘时，嗜酸性粒细胞不 显著(Fabbri L，Beghe B，Caramori G，Papi A 和 Saetta M(1998)Similarities and discrepancies between exacerbations of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Thorax53:803-808 ；Fabbri LM, Romagnoli M，Corbetta L，Casoni G, Busljetic K，Turato G，Ligabue G，Ciaccia A，Saetta M 和 Papi A (2003)Differences in airway inflammation in patients with fixed airflow obstruction due to asthma or chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167:418-424.) 〇
[0008] 因此，慢性阻塞性肺病（C0PD)的治疗方法将不同于哮喘的治疗方法，但是，现有 疗法已经致力于非特定地治疗两种疾病。因此，尚无抗炎疗法特定地批准用于C0PD，并 且可用的抗炎疗法起初被开发用于哮喘。面对C0PD的研究的挑战是多方面的；潜藏在该 疾病下的复杂和多样的病理学的机制需要阐明；需要确认疾病发展中炎症的作用（Hele Dj,Belvisi MG,2003. Novel therapies for the treatment of inflammatory airway disease, Expert. Opino. Invest. Drug, 12:5-18 ； J Craig Fox 和 Mary F Fitzgerald ； The role of animal models in the pharmacological evaluation of emerging anti-inflammatory agents for the treatment of C0PD，Current Opinion in Pharmacology 2009,9:231_242)。
[0009] 对较长效0激动剂、较安全类固醇和结合疗法形式的治疗哮喘有用的现有疗法 的改善正在不断进行，并且向coro抗胆碱能药提供症状缓解。已经利用类固醇来治疗恶 化，但是，到现在为止，尚无疗法显示出对C0PD中的肺功能的逐渐下降或哮喘的发展有显 著影响。
[0010] 因此，直到现在有很多研究来开发可能成功或特定治疗C0PD的新药。
[0011] 本发明的发明人已经致力于开发源自具有安全性和功效的天然资源（如，具有 抑制炎性细胞繁殖的活性的效力的植物、动物等）的有效力的治疗剂，并且最终发现长 叶婆婆纳（Pseudolysimachion longifolium)的提取物显示出有效力的抗发炎、抗过敏 和抗哮喘活性（韩国专利第10-860080号），并且从此分离的各种化合物，如毛蕊花甙 (6-0-3, 4-二羟基苯甲酰基梓醇）、胡黄连苷II (6-0-4-羟基-3-甲氧基苯甲酰基梓醇）、梓 醇6-咖啡酸酯（6-0-3, 4-二羟基肉桂酰基梓醇）、6-0-藜芦酰梓醇（6-0-3, 4-二甲氧基苯 甲酰基梓醇）、米内戒（minecoside) (6-0-3-羟基-4-甲氧基肉桂酰基梓醇）、梓醇等，也显 示出有效力的抗发炎、抗过敏和抗哮喘活性（韩国专利公开第10-2006-125499号）。
[0012] 东北婆婆纳是分布在韩国、中国、日本、萨哈林岛（Ostrov Sakhalin)、和俄罗斯的 多年生草本植物。
[0013] 基于在韩国专利第10-860080号中公开的长叶婆婆纳的提取物的抗发炎、抗过敏 和抗哮喘活性的先前研究，本发明的发明人已尝试开发从东北婆婆纳的提取物分离的显示 抗炎、抗过敏和抗哮喘活性的更有效且更大量的成分的更有效率的制备方法。
[0014] 然而，尚未有报道或公开有关用于制备从东北婆婆纳的提取物分离的比在上述引 用的文献中更有效且更大量的显示抗炎、抗过敏和抗哮喘活性的成分的有效方法，上述引 用的文献所公开的内容在此通过引用并入本文中。
[0015] 因此，本发明的发明人已经发现用于从东北婆婆纳的提取物制备含有较大量活 性成分（如，梓醇）的纯化提取物的新工业化方法，并且通过利用BALB/c雄性小鼠进行 的各种体内试验（例如，由C0PD发生导致的招募至肺的炎性免疫细胞和嗜中性粒细胞的 增殖和活性的抑制试验；参与肺细胞的损坏的趋化因子（如，MIP-2/CXCL-2、TNF-a、KC/ CXCL-1 (趋化因子Gro- a )和CXCL-8等）的再生的抑制试验；在利用SPF (无特定病原体） Sprague-Dawley大鼠的动物试验中通过降低NF-kB活性减少对IL-1 0、IL-6、TNF- a和 MMP-9表达的释放的影响）以及在分子表达谱变化试验中诱导对Th2细胞的IL-4-表达的 影响的体外试验（例如，对MUC5AC (低聚粘液/凝胶形成）的表达的抑制试验），所述纯化 提取物和从此分离的化合物显示出有效力的抗coro活性而无0-2-受体对抗应答。
【发明内容】
[0016] 技术问题
[0017] 本发明提供一种包含来自东北婆婆纳的含有活性成分（如梓醇衍生物）的新纯化 提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-0-藜芦酰梓醇的至 少一种化合物的药物组合物和保健食品，以治疗和预防慢性阻塞性肺病（C0PD)。
[0018] 本发明还提供来自东北婆婆纳的含有活性成分（如梓醇衍生物）的新纯化提取物 或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-0-藜芦酰梓醇的至少一种 化合物用于治疗和预防慢性阻塞性肺病（C0PD)的用途。
[0019] 本发明还提供治疗或预防哺乳动物的慢性阻塞性肺病（C0PD)的方法，其包括向 该哺乳动物施用有效量的来自东北婆婆纳的含有活性成分（如梓醇衍生物）的新纯化提取 物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-0-藜芦酰梓醇的至少一 种化合物，和它们制药上可接受的载体。
[0020] 技术方案
[0021] 因此，本发明的目的是提供一种包含来自东北婆婆纳的含有活性成分（如梓醇 衍生物）的新纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和 6-0-藜芦酰梓醇的至少一种化合物的药物组合物和保健食品，以治疗和预防慢性阻塞性肺 病（coro)。
[0022] 在此公开的术语"梓醇衍生物"包括毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和 6-0-藜芦酰梓醇等。
[0023] 在此公开的术语"东北婆婆纳"包括培养的或天然生长的植物和市售的植物，但不 意欲限制到上述范围内。
[0024] 在此公开的术语"新的纯化提取物"包含：(a)用丁醇分馏的纯化提取物（下文中 称为"ATC1"）和（b)用二级分馏的纯化提取物（下文中称为"ATC2"）。
[0025] 具体地，术语"用丁醇分馏的纯化提取物（ATC1) "的特征在于，基于东北婆婆纳的 总提取物的重量（100% )，含有15-50% (w/w)毛蕊花甙、0. 3-10% (w/w)藜芦酸、0. 5-10% (w/w)梓苷、0.3-10% (w/w)胡黄连苷 II、0. 3-10% (w/w)异香草酰梓醇和 0.3-10% (w/ w)6-0-藜芦酰梓醇；优选地，基于东北婆婆纳的总提取物的重量（100% )，含有20-25% (￥/\￥)毛蕊花戒、0.5-5%^/\￥)藜芦酸、1-5%(￥/\￥)梓苷、0.5-5%(￥/\￥)胡黄连苷11、 0.5-5% (w/w)异香草酰梓醇和1-5% (w/w) 6-0-藜芦酰梓醇；
[0026] 和/或，其特征在于，在东北婆婆纳的总提取物（100% )中含有12. 3-47% (w/ w)梓苷衍生物，且各种梓苷衍生物的重量之间具有如下的相对混合比（w/w) :15. 0-18.0 份（w/w)毛蕊花戒、2. 10-2. 60 份（w/w)梓苷、1 份（w/w)胡黄连苷 II、1. 00-1. 30 份（w/w) 异香草酰梓醇以及2. 00-2. 30份（w/w) 6-0-藜芦酰梓醇；优选地，16. 0-17. 0份（w/w)毛 蕊花戒、2. 20-2. 50份（w/w)梓苷、1份（w/w)胡黄连苷II、1. 10-1. 20份（w/w)异香草酰 梓醇以及2. 10-2. 20份（w/w) 6-0-藜芦酰梓醇；更优选地，16. 20-16. 99份（w/w)毛蕊花 戒、2. 40-2. 45份（w/w)梓苷、1份（w/w)胡黄连苷II、1. 10-1. 19份（w/w)异香草酰梓醇、 2. 10-2. 19 份（w/w) 6-0-藜芦酰梓醇。
[0027] 更具体地，术语"用丁醇分馏的纯化提取物（ATC1) "的特征在于，通过如下方法制 备：在第一步中，向干燥的东北婆婆纳中加入选自水、C1-C4低级醇（例如甲醇、乙醇、丁醇 等）或它们的混合物的至少一种提取溶剂，优选水和乙醇的混合物，更优选30 - 80% (w/ w)乙醇的水溶液；在第二步中，在10至100°C、优选20至90°C的温度范围内进行选自热水 回流提取、冷水提取、超声波处理或常规提取（优选冷水提取接着回流提取）中的至少一种 提取方法30分钟至72小时、优选6至48小时的时间，更优选地，在10至60°C、优选20至 50°C的温度范围内进行冷水提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时间，然后在40至 120 °C、优选60至90 °C的温度范围内进行回流提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时 间，反复进行，以获得第一提取物；在第三步中，将所述第一提取物悬浮在约〇. 5-10倍体积 (v/V)、优选约1-5倍体积（v/v)的水中，以得到悬浮提取物；以及加入约0. 5-20倍体积（v/ v)、优选约1-10倍体积（v/V)的丁醇，分馏为水层和丁醇层并收集丁醇层以得到用丁醇分 馏的纯化提取物（ATC1)，以治疗和预防慢性阻塞性肺病（COPD)，基于东北婆婆纳的总提取 物的重量（100% )，所述用丁醇分馏的纯化提取物含有15-50% (w/w)毛蕊花甙、0.3-10% (w/w)藜芦酸、0.5-10% (w/w)梓苷、0.3-10% (w/w)胡黄连苷 II、0. 3-10% (w/w)异香草 酰梓醇和〇. 3-10 % (w/w) 6-0-藜芦酰梓醇。
[0028] 因此，在本发明的另一个实施方式中，本发明还提供了用于制备从东北婆婆纳中 分离出的用丁醇分馏的纯化提取物（ATC1)的方法，包括以下步骤：在第一步中，向干燥的 东北婆婆纳中加入选自水、C1-C4低级醇（例如甲醇、乙醇、丁醇等）或它们的混合物的至 少一种提取溶剂，优选水和乙醇的混合物，更优选30 - 80% (w/w)乙醇的水溶液；在第二 步中，在10至100°C、优选20至90°C的温度范围内进行选自热水回流提取、冷水提取、超 声波处理或常规提取中的至少一种提取方法30分钟至72小时，优选6至48小时的时间， 优选冷水提取后接着回流提取，更优选地，在10至60°C、优选20至50°C的温度范围内进 行冷水提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时间，然后在40至120°C、优选60至 90°C的温度范围内进行回流提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时间，反复进行， 以获得第一提取物；在第三步中，将所述第一提取物悬浮在约〇. 5-10倍体积（v/v)、优选 约1-5倍体积（v/v)的水中，以得到悬浮提取物；以及加入约0. 5-20倍体积（v/v)、优选 约1-10倍体积（v/v)的丁醇，分馏为水层和丁醇层并收集丁醇层以得到用丁醇分馏的纯化 提取物（ATC1)，以治疗和预防慢性阻塞性肺病（C0PD)，基于东北婆婆纳的总提取物的重量 (100% )，所述用丁醇分馏的纯化提取物（ATC1)含有15-50% (w/w)毛蕊花甙、0.3-10% (w/w)藜芦酸、0.5-10% (w/w)梓苷、0.3-10% (w/w)胡黄连苷 II、0. 3-10% (w/w)异香草 酰梓醇和〇. 3-10 % (w/w) 6-0-藜芦酰梓醇。
[0029] 具体地，术语"用二级分馏的纯化提取物（ATC2) "的特征在于，基于东北婆婆纳的 总提取物的重量（100%)，含有30-60% (w/w)毛蕊花甙、0.5-10% (w/w)藜芦酸、2-20% (￥/\￥)梓苷、1-10%^/\￥)胡黄连苷11、1-10%(￥/\￥)异香草酰梓醇和2-20%(￥/\￥)6-0-藜 芦酰梓醇；优选地，基于东北婆婆纳的总提取物的重量（100% )，含有40-50% (w/w)毛蕊 花戒、1-5% (w/w)藜芦酸、3-10% (w/w)梓苷、2-5% (w/w)胡黄连苷 II、2_8% (w/w)异香 草酰梓醇和3-8% (w/w) 6-0-藜芦酰梓醇；
[0030] 和/或，其特征在于，在东北婆婆纳的总提取物（100% )中含有36. 5-91% (w/ W)梓苷衍生物，且各种梓苷衍生物的重量之间具有如下的相对混合比（w/w) :13. 0-16.0 份（w/w)毛蕊花戒、2. 20-2. 50 份（w/w)梓苷、1 份（w/w)胡黄连苷 II、1. 10-1. 40 份（w/w) 异香草酰梓醇以及2. 00-2. 20份（w/w) 6-0-藜芦酰梓醇；优选地，14. 0-15. 0份（w/w)毛 蕊花戒、2. 30-2. 45份（w/w)梓苷、1份（w/w)胡黄连苷II、1. 20-1. 35份（w/w)异香草酰 梓醇以及2. 00-2. 10份（w/w) 6-0-藜芦酰梓醇；更优选地，14. 50-14. 99份（w/w)毛蕊花 戒、2. 35-2. 43份（w/w)梓苷、1份（w/w)胡黄连苷II、1. 25-1. 34份（w/w)异香草酰梓醇、 2. 01-2. 09 份（w/w) 6-0-藜芦酰梓醇。
[0031] 更具体地，术语"用二级分馏的纯化提取物（ATC2) "的特征在于，通过如下方法制 备：在第一步中，向干燥的东北婆婆纳中加入选自水、C1-C4低级醇（例如甲醇、乙醇、丁醇 等）或它们的混合物的至少一种提取溶剂，优选水和乙醇的混合物，更优选30-80(w/w)乙 醇的水溶液；在第二步中，在10至l〇〇°C、优选20至90°C的温度范围内进行选自热水回流 提取、冷水提取、超声波处理或常规提取的至少一种提取方法30分钟至72小时、优选6至 48小时的时间，优选冷水提取后，接着回流提取，更优选地，在10至60°C、优选20至50°C的 温度范围内进行冷水提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时间，然后在40至120°C、 优选60至90°C的温度范围内进行回流提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时间， 反复进行，以获得第一提取物；在第三步中，将所述第一提取物悬浮在约〇. 5-10倍体积（v/ v) 、优选约1-5倍体积（v/v)的水中，以得到悬浮提取物；在第三步中，加入约0. 5-20倍体 积（v/V)、优选约1-10倍体积（v/V)的丁醇，分馏为水层和丁醇层并收集丁醇层以得到用丁 醇分馏的纯化提取物（ATC1);以及对用丁醇分馏的纯化提取物（ATC1)进行选自反相分配 色谱、正相分配色谱、离子交换色谱以及尺寸排斥色谱的至少一种纯化工艺以得到用二级 分馏的纯化提取物（ATC2)，以治疗或预防慢性阻塞性肺病（COPD)，基于东北婆婆纳的总提 取物的重量（100%)，所述用二级分馏的纯化提取物（ATC2)含有30-60% (w/w)毛蕊花甙、 0. 5-10% (w/w)藜芦酸、2-20% (w/w)梓苷、1-10% (w/w)胡黄连苷 II、1_10% (w/w)异香 草酰梓醇和2-20 % (w/w) 6-0-藜芦酰梓醇。
[0032] 因此，在本发明的另一个实施方式中，本发明还提供用于制备从东北婆婆纳中分 离出的用二级分馏的纯化提取物（ATC2)