多重抗药性大肠杆菌特异性抗体的制作方法

文档序号:9400191阅读:664来源:国知局
多重抗药性大肠杆菌特异性抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的LPS 025b抗原特异性结合 的抗体。
【背景技术】
[0002] 脂多糖(LPS)是大肠杆菌病原体表面上数量最多的抗原。一般说来,LPS具有三 个结构部分:1)脂类A(亦称为内毒素),ii)核心寡糖,及iii)〇-抗原。后者由3-6个糖 的重复亚单位组成(取决于血清型)。脂类A和核心0S在一种单个肠道杆菌种中是相对地 非常保守的,但是,抗体接近它们是有限制的。另一方面,〇-抗原是极易接近的,但是,其结 构多样(在大肠杆菌中,有大约180种不同的0-型)。
[0003] 0-抗原的抗体能够与大肠杆菌表面结合,因此,它们用于诊断(如流行病学研究 的〇-型)以及作为治疗措施。但是,由于结构变化多样,〇-抗原特异性抗体的广谱保护非 常麻烦。
[0004] 大肠杆菌引起的肠胃外感染很常见,导致发病率和死亡率较高。最近发现的大肠 杆菌多重抗药性(MDR)菌株导致的感染占大肠杆菌感染的很大一部分。
[0005] 由于这些MDR菌株已经进化为对临床使用的大多数抗生素具有耐药性,因此,针 对它们的治疗方案很受限制。因此,替代的治疗方案,如单克隆抗体(mAbs)被动免疫法在 将来具有良好的前景。
[0006] 过去几年里,出现了定义明确的MDR大肠杆菌克隆谱系ST131-025b:H4,该谱系 导致的感染占所有肠胃外大肠杆菌感染的大约10%,以及占MDR大肠杆菌感染的大约 一半(Peirano et al. Int J Antimicrob Agents 2010Apr ;35 (4):316-21 ;Rogers et al.J Antimicrob Chemother 2011Jan ;66(1):1-14 ;ffoodford et al. FEMS MicrobiolRev 2011Sep ;35(5) :736-55.)。属于该谱系的菌株表现出有限的异质性,因此,可认为与抗原 库非常类似。属于这一簇的大多数菌株表达〇25b抗原,因此,采用编码合成此抗原的酶的 特异性基因(LPS合成位点内)来鉴定此克隆(Clermont et al.J Antimicrob Chemother 2008May ;61 (5) : 1024-8.)。或者,可以利用025分型血清的凝集作用,但是,正如基因差异 所示,这种谱系的〇抗原(因此,被称为〇25b)与标准的025抗原不同。但是,025分型血 清无法区分非-MDR 025和MDR 025b克隆。
[0007] Rogers et al. (J Antimicrob Chemother 2011 Jan ;66 (1) : 1-14)描述 了利用 三个主要特点,即其血清组(〇25b)、其系统发育组(B2)和其ST(ST131)检测大肠杆菌 025b-ST131菌株。这三个特点被公开用于协助检测。描述了各种分子技术,即MLST、基于 PCR的快速检测法、重复序列PCR和PFGE。包括各种免疫球蛋白的多克隆抗血清(抗025a 菌株)用于测定025抗原,不区分亚型。
[0008] Jadhav et al. (PL0S ONE 2011 ;6(3) :el8063)描述了对 025b 亚群呈阳性的菌株 的毒性特点和基因亲和力,所述〇25b亚群与B2-025b-ST131-CTX-M-15有毒的/多重抗药 性型连接。对人类临床分离菌进行了分析,并划分为各种血清型,得到了毒性标记谱。采用 抗0-抗原多克隆抗血清-01至0173,通过血清型鉴定了 025阳性菌株。025阳性菌株进一 步通过靶向rfb025b亚群基因位点的等位基因特异性PCR进行基因分型。
[0009] Mora et al. (Int.J. Antimicrobial Agents 2011 ;37 (1):16-21)描述了产 CTX-M-14大肠杆菌临床分离菌中的某些克隆组的出现,其中有025b :H4-B2-ST131。0型用 特异性〇抗血清处理(多克隆)。
[0010] Clermont et al. (J Antimicrob Chemother 2008May ;61 (5) : 1024-8)公开了 025b ST131大肠杆菌的等位基因特异性pabB PCR试验。
[0011] Szijartoetal,(FEMSMicrobiolLett2012 ;332:131-6)描述了以 LPS分子核 心结构为基础的大肠杆菌分离菌的分子分型。分离菌的核心类型采用分别靶向核心操纵子 中的基因和对R1-4和K-12核心类型具有特异性的引物,采用PCR进行测定。

【发明内容】

[0012] 本发明的目的是提供特异性改善的大肠杆菌MDR菌株的抗体,用于预防或治疗由 携带LPS 025b的菌株引起的大肠杆菌感染。本发明进一步的目的是提供能够快速、可靠的 诊断MDR大肠杆菌的手段和方法。
[0013] 本发明的目的通过本发明的主题实现。
[0014] 根据本发明,提供了一种与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的025b抗原特异性结 合的分离抗体。
[0015] 特别地,所述抗体是单克隆抗体。
[0016] 特别地,所述抗体只与025b抗原特异性结合,或与025a和025b抗原共享的表位 交叉特异性结合。
[0017] 根据本发明一个具体的方面,例如,所述抗体与025b和025或025a抗原交叉特异 性结合的亲和力相等、大于相等、类似或不同。
[0018] 特别地,相对大肠杆菌的025a抗原,本发明的抗体优选与025b抗原结合,或与这 种两种抗原结合的亲和力至少相等。
[0019] 根据本发明的一个具体实施例,抗体与〇25b抗原结合的亲和力比与025a抗原结 合的亲和力至少大2倍,特别是结合025b或025a时,两者的亲和力和/或亲合力差别至少 是两倍,或至少是三倍,至少是四倍,至少是五倍,或甚至至少是10倍。
[0020] 根据本发明的一个具体方面,与025b特异性结合的特征在于,采用免疫测定法, 优选免疫印迹法、ELISA或其它免疫学方法进行测定时,与025b抗原结合的亲和力大于抗 025或025a大肠杆菌菌株的多克隆血清与025b抗原结合的亲和力。亲和力更高,特别地相 差至少两倍,或至少三倍、至少四倍、至少5-倍,或甚至至少10-倍。
[0021] 特别地,本发明抗体靶向的025b抗原在一个或多个,及特别是在大多数ST131菌 株中普遍存在。
[0022] 特别地,抗体识别的表位存在于胶囊化(encapsulated)和非胶囊化 ST131-025b:H4菌株的表面上,如突变株的表面上。
[0023] 根据本发明进一步的方面,抗体具有全长单克隆抗体或其抗体片段的结合位点, 包括至少一个掺入结合位点的抗体域,其中,抗体优选是选自鼠科动物抗体、美洲驼马 (lama)抗体、兔抗体、羊抗体、牛抗体、嵌合抗体、人源化的或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、 scFv和单域抗体,如VH、VHH或VL,优选是人IgG抗体或鼠源性IgG抗体。
[0024] 根据本发明进一步的方面,抗体结合025b抗原的亲和力Kd小于10 7M,优选小于 10 SM,特别是在单体状态。
[0025] 根据本发明进一步的具体方面,抗体在包含活的野生型MDR大肠杆菌菌株的血清 样品中显不具有体外杀菌效用。
[0026] 根据本发明进一步的具体方面,抗体在体外刺激吞噬细胞吸收活的野生型MDR大 肠杆菌菌株。
[0027] 根据本发明进一步的具体方面,所述抗体与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体结 合的表位相同。
[0028] 根据本发明进一步的具体方面,所述抗体包括与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗 体相同的结合位点。
[0029] 根据本发明的具体方面,本发明提供特异性结合到多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌 株的〇25b抗原的分离单克隆抗体,其包括抗体8D5-1G10,或源自抗体8D5-1G10,或抗体 8D5-1G10的功能活性变体的抗原-结合位点,优选其中所述抗体8D5-1G10具有以下特点:
[0030] a)以保藏号DSM 26763保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区;与/或
[0031] b)以保藏号DSM26762保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区;
[0032] c)或采用(a)与/或(b)的功能活性变体。
[0033] 根据具体的实施例,所述抗体是8D5-1G10抗体或其功能活性变体。
[0034] 本发明其它抗体在此列出,命名为6D1-1B2和8A1-1G8。这些抗体是具有类似 8D5-1G10的⑶R序列的克隆,在此本发明中亦理解为功能活性⑶R变体。
[0035] 特别地,命名为8D5-1G10的抗体由抗体轻链和抗体重链组成,抗体轻链包括以保 藏号DSM 26763保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒编码序列所编码的可变区,抗体重 链包括以保藏号DSM 26762保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒编码序列所编码的可 变区。
[0036] 根据本发明进一步的具体方面,抗体源自8D5-1G10抗体,其中
[0037] -抗体轻链的可变区是通过以保藏号DSM 26763保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含 的质粒进行编码,或其功能活性变体;与/或;
[0038] -抗体重链的可变区是通过以保藏号DSM26762保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含 的质粒进行编码,或其功能活性变体。
[0039] 根据本发明进一步的具体方面,所述抗体源自一个抗体,其中
[0040] -抗体轻链的可变区是通过以保藏号DSM 26763保藏的宿主细胞产生,或其功能 活性变体;与/或
[0041] _抗体重链的可变区是通过以保藏号DSM 26762保藏的宿主细胞产生,或其功能 活性变体。
[0042] 根据本发明的另一个具体方面,本发明提供一分离的单克隆抗体,所述抗体与 025a和025b抗原共享的表位特异性结合,以及所述抗体包括抗体8D10-C8,或源自抗体 8D10-C8,或是抗体8D10-C8的功能活性变体的抗原结合位点,优选其中抗体8D10-C8的特 征是:
[0043] a)以保藏号DSM28171保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区;与/或
[0044] b)以保藏号DSM28172保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区;
[0045] c)或采用(a)与/或(b)的功能活性变体。
[0046] 根据具体的实施例,抗体是8D10-C8抗体或其功能活性变体。
[0047] 特别地,命名为8D10-C8的抗体由抗体轻链和抗体重链组成,抗体轻链包括保藏 号DSM28171的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒编码序列所编码的可变区,抗体重链包括 保藏号DSM 28172的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒编码序列所编码的可变区。
[0048] 根据本发明进一步的具体方面,抗体源自8D10-C8抗体,其中
[0049]-抗体轻链的可变区是通过保藏号DSM28171的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒 进行编码,或其功能活性变体;与/或
[0050]-抗体轻链的可变区是通过保藏号DSM28172的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒 进行编码,或其功能活性变体。
[0051] 根据本发明进一步的具体方面,所述抗体源自一个抗体,其中
[0052]-抗体轻链的可变区是通过保藏号DSM 28171的宿主细胞产生,或其功能活性变 体;与/或
[0053]-抗体重链的可变区是通过保藏号DSM28172的宿主细胞产生,或其功能活性变 体。
[0054] 具体地说,功能活性变体是⑶R变体,例如,该变体包括⑶R,更具体地是包括⑶R 环序列,含序列一致性至少60 %,优选至少70 %、80 %或90 %的氨基酸序列。
[0055] 特别地,抗体源自这样的抗体,采用各自的CDR序列,或CDR突变体,包括功能活性 的⑶R变体,如一个⑶R环内具有1、2或3个点突变。
[0056] 具体地说,功能活性变体与母抗体在氨基酸序列中,优选在CDR中,至少有一个点 突变不同,其中每个CDR氨基酸序列中点突变的数量是0、1、2或3个。
[0057] 根据进一步的具体方面,本发明提供包含以下核苷酸序列的质粒:
[0058] A
[0059]-对保藏号DSM 26763的宿主细胞中包含的命名为8D5-1G10-LC的抗体轻链可变 区进行编码;与/或
[0060]-对保藏号DSM 26762的宿主细胞中包含的命名为8D5-1G10-HC的抗体重链可变 区进行编码;
[0061] 或 B
[0062]-对保藏号DSM 28171的宿主细胞中包含的命名为8D10-C8-LC的抗体轻链可变区 进行编码;与/或
[0063] -对保藏号DSM 28172的宿主细胞中包含的命名为8D10-C8-HC的抗体重链可变区 进行编码。
[0064] 根据本发明进一步的具体方面,本发明提供一种表达盒,包括表达本发明抗体轻 链与/或重链的编码序列,所述表达盒或编码序列源自选自由本发明质粒组成的群组中的 质粒。
[0065] 根据本发明进一步的具体方面,本发明提供一种制备本发明抗体的方法,其中宿 主细胞采用本发明的质粒或表达盒转化。
[0066]根据本发明进一步的具体方面,本发明提供包含本发明质粒或表达盒的宿主细 胞。
[0067] 特别地,宿主细胞保藏号为
[0068] A
[0069] DSM 26763 与 / 或 DSM 26762;
[0070]或 B
[0071] DSM 28171 与 / 或 DSM 28172。
[0072] 具体的实施例涉及一种制备本发明抗体的方法,其中本发明的宿主细胞在一定条 件下培养或保持,从而制备所述抗体。
[0073] 根据本发明进一步的具体方面,本发明提供鉴定候选抗体的方法,包括:
[0074] (a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品;及
[0075] (b)对样品中的抗体或样品产生的抗体与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体识别 的表位的结合进行评价,其中抗体和表位之间的阳性反应鉴定该抗体为候选抗体。
[0076] 根据本发明进一步的具体方面,本发明提供鉴定候选抗体的方法,包括:
[0077] (a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品;及
[0078] (b)对样品中的抗体或样品产生的抗体与ST131-025b:H4菌株的025b抗原及 非-MDR大肠杆菌菌株的025b抗原,或025a抗原的结合进行评价,其中相对于025抗原或 〇25a抗原,抗体与025b抗原之间的特异性阳性反应鉴定该抗体为候选抗体。
[0079] 特别地,候选抗体是一种候选保护性抗体,如用于治疗,或候选诊断抗体。
[0080] 此外,根据本发明进一步的具体方面,本发明提供一种制备本发明抗体的方法,包 括
[0081] (a)提供一种根据本发明鉴定的候选抗体;及
[0082] (b)制备一种候选抗体的单克隆抗体,或人源化抗体或人源抗体,或它们的衍生 物,所述衍生物与候选抗体具有相同表位结合特异性。
[0083] 根据本发明另一个具体方面,本发明提供一种制备本发明抗体的方法,包括
[0084](a)采用命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体识别表位对非人动物进行免疫;
[0085](b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系;
[0086] (c)筛选b)中获得的细胞系,鉴定细胞系产生与表位结合的单克隆抗体;及
[0087](d)产生所述单克隆抗体,或该抗体的人源化抗体或人源抗体,或它们的衍生物, 该衍生物其与所述单克隆抗体具有相同表位结合特异性。
[0088] 根据本发明另一个具体方面,本发明提供一种制备本发明抗体的方法,包括
[0089] (a)采用ST131_025b:H4菌株的025b抗原对非人动物进行免疫,并分离产生抗体 的B-细胞;
[0090] (b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系;
[0091] (c)筛选细胞系,鉴定产生单克隆抗体的细胞系,相对于大肠杆菌的025抗原或 〇25a抗原,所述单克隆抗体优选与025b抗原结合;及
[0092] (d)产生所述单克隆抗体,或该抗体的人源化抗体或人源抗体,或它们的衍生物, 该衍生物与所述单克隆抗体具有相同表位结合特异性。
[0093] 根据本发明进一步的方面,本发明提供本发明抗体的医疗用途。具体地说,抗体提 供用于处理承受MDR大肠杆菌感染风险或遭受MDR大肠杆菌感染的对象的用途,包括使对 象服用有效剂量的抗体,限制对象的感染或使所述感染引起的病情好转,优选用于治疗或 预防肾盂肾炎、第二次菌血症、脓毒病、腹膜炎、脑膜炎和呼吸机相关性肺炎。
[0094] 特别地,抗体用于消灭MDR大肠杆菌,优选ST131-025b:H4菌株,而不考虑该菌株 表达的荚膜多糖。
[0095] 根据具体的方面,本发明进一步提供一种处理方法,其中处理承受MDR大肠杆菌 感染风险或遭受MDR大肠杆菌感染的对象,方法包括,使对象服用有效剂量的抗体,以限制 对象的感染或使所述感染引起的病情好转,优选用于治疗或预防肾盂肾炎、第二次菌血症、 脓毒病、腹膜炎、脑膜炎和呼吸机相关性肺炎的方法。
[0096] 特别地,所述处理方法用于消灭MDR大肠杆菌,优选ST131-025b:H4菌株,而不考 虑菌株表达的荚膜多糖。
[0097] 根据具体的一方面,采用本发明抗体的免疫疗法可以有效防御活细菌挑战,如各 种动物模型中测定的挑战。
[0098] 抗体可以特异性中和致命的内毒素血症。这种功能活性可以在合适的体内模型中 (采用纯化LPS挑战)测定。
[0099] 所述抗体在通过补体介导杀灭MDR大肠杆菌方面特别有效,例如,如体外血清杀 菌试验(SBA)测定的那样,例如,杀灭细菌比对照样品(不加入抗体或不相关对照mAb)至 少尚20 %。
[0100] 所述抗体在通过抗体介导吞噬作用杀灭MDR大肠杆菌方面特别有效,例如,如体 外调理吞噬杀菌试验(0PK)测定的那样,例如,输入细菌的吸收量比对照样品(不加入抗体 或加入不相关对照mAb)至少高20%,或最终cfu数比对照样低20%。
[0101] 所述抗体在通过中和内毒素功能杀灭MDR大肠杆菌方面特别有效,例如,如体外 LAL试验所测定的那样,或Toll样受体4(TLR4)报告试验测定的那样,与对照样品(不加入 抗体或加入不相关对照mAb)相比,内毒素活性下降至少20%。
[0102] 根据一个具体实施例,抗体以肠胃外或粘膜制剂施用。
[0103] 根据本发明进一步的方面,本发明提供本发明抗体的药物制剂,优选包括肠胃外 或粘膜制剂,可选包含药学上可接受的载体或赋形剂。
[0104] 根据本发明进一步的方面,本发明提供本发明抗体的诊断用途,用于检测或测定 对象中表达LPS 025b抗原的MDR菌株导致的大肠杆菌感染,如上下尿路感染,包括膀胱炎 或尿道炎,上行性或血源性肾盂肾炎,特别是糖尿病患者中的,以及菌血症、脓毒病、腹膜炎 或肠道定植。
[0105] 特别地,提供本发明所述用途的抗体,其中通过在体外用所述抗体接触对象的体 液样品,测定所述对象的全身性MDR大肠杆菌感染,其中抗体的特异性免疫反应确定感染。
[0106] 特别地,测试体液样品的特异性免疫反应,样品选自尿液、血液、血液分离物或血 液培养、抽出物、唾液、插管患者灌洗液和大便。
[0107] 特别地,本发明的诊断用途指的是根据临床标本中回收的纯大肠杆菌,体外测定 大肠杆菌的血清型。
[0108] 根据另一方面,本发明提供本发明抗体的诊断制剂,可选包含带标记的抗体与/ 或其它带标记的诊断试剂,如利用各自的靶抗原特异性识别抗体或抗体免疫复合物的试 剂,与/或固定至少其中一种抗体和诊断试剂的固相。诊断制剂可以是组合物的形式提供 或作为试剂盒部分提供,例如,包含各组分,如包括以下各项的组分:
[0109] a)诊断抗体制剂,与/或
[0110] b)其它诊断试剂,
[0111] 与/或固定至少一种抗体和诊断试剂的固相,固相作为独立的组分,或作为以上 a)与/或b)任一组分的载体。
[0112] 本发明优选的诊断分析包括将本发明的抗体固定在固相上,例如,乳胶珠粒、金颗
当前第1页1 2 3 4 5 6 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1