造影剂及其制造方法和制造试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及造影剂及其制造方法和制造试剂盒。
【背景技术】
[0002] 长久以来，X射线CT、MRI、超声波诊断装置等图像诊断方式在医疗现场是必须的 工具。它们分别将生物体内的CT值、自旋弛豫时间、声阻抗的差异进行图像化，这些物理性 质的差异专门反映生物体的结构（形状），因此被称为"形态成像"。
[0003] 与此相对，将对于即使在结构上为相同组织、但在功能上处于不同状态的部位进 行图像化的技术称为"功能成像"。在该功能成像中，特别是对蛋白质等生物体构成分子的 存在状态进行可视化的技术多被称为"分子成像"。分子成像可以期待应用于发生、分化等 生命现象的阐明和疾病的诊断、治疗，因此是目前最受关注的研究领域之一。
[0004] 在分子成像中，多使用"分子探针"，该分子探针是具有对生物体构成分子具有选 择性的结构的物质，这种情况下，对分子探针附加能够利用某种物理手段进行检测的结构， 使分子探针在体内的分布可视化。近年来，将这样的分子成像用于早期诊断的动向加速。
[0005] 对于之前用于上述的形态成像用途的MRI、超声波诊断装置等方式，也进行了用于 分子成像的研究开发。此外，由于超声波诊断装置具有：（1)实时性优异；(2)小型化因而在 手术室内使用的相关限制少；（3)不仅能够诊断、而且还能够作为治疗用工具使用；等其他 设备所不具备的特长，因此，作为在大型医院以外也能够使用的诊断治疗综合工具而受到 期待。
[0006] 以往，为了实现"疾病的早期诊断"中的分子成像，作为超声波造影剂，已知有使用 了液体的微气泡前体的部位特异性（site specific)水包油型乳液（例如，参见专利文献 1)〇
[0007] 该微气泡前体中，气体形成性化学物质的乳液能够在液体状态下处于稳定。并且， 提出了可从血管移动到组织中的尺寸的造影剂，其为在被施加超声波能量时产生微小气泡 的造影剂。
[0008] 该微气泡前体是在施与至生物体时通过对纳米尺寸的液滴照射超声波而产生相 变、从而生成微气泡的相变型超声波造影剂。由于具有在施加超声波能量时形成微小气泡 的能力，因此，能够成为部位特异性造影剂，并且，通过进一步附加抗体、配体等与生物体构 成分子选择性结合的分子探针而能够使其具有组织选择性。
[0009] 现有技术文献
[0010] 专利文献
[0011] 专利文献1 :日本专利第3016592号公报
【发明内容】
[0012] 发明所要解决的课题
[0013] 但是，专利文献1的由微气泡前体形成的超声波造影剂存在无法判断其存在于细 胞内外的何处的问题。特别是存在无法判断其是否被纳入到细胞内的问题。
[0014] 本发明是鉴于上述情况而进行的，其目的在于提供一种能够容易地确认到已被纳 入到细胞内的造影剂及其制造方法和制造试剂盒。
[0015] 解决课题的手段
[0016] 为了达成上述目的，本发明提供下述手段。
[0017] 本发明的一个方式提供一种造影剂，其是在具有超声波造影功能的基材的表面具 备至少1个靶向用的分子探针和至少1个光学探针的造影剂。
[0018] 在上述方式中，可以具备偶联用的第1分子探针、标记在第2分子探针上的光学探 针、以及与疾病特异性细胞或组织结合的靶向用的第3分子探针。
[0019] 另外，在上述方式中，上述第3分子探针可以由上述第1分子探针进行了标记。 [0020]另外，在上述方式中，上述第2分子探针和上述第3分子探针可以以摩尔比1:1的 比例含有。
[0021 ] 另外，在上述方式中，上述基材可以为胶囊状造影剂，该胶囊状造影剂的内部内包 有具有造影功能的造影物质，且该胶囊状造影剂具有由脂质膜形成的外壳。
[0022] 另外，在上述方式中，上述造影物质可以通过超声波照射而气化的不溶于水的物 质。
[0023] 此外，在上述方式中，上述造影物质可以为气体。
[0024] 此外，本发明的另一方式提供上述造影剂的制造方法，其包含下述步骤：第1步 骤，生成将上述第1分子探针标记于上述基材的表面而得到的第1溶液；第2步骤，生成将 上述光学探针标记于上述第2分子探针上而得到的第2溶液；第3步骤，生成将上述第1分 子探针标记于上述第3分子探针上而得到的第3溶液；第4步骤，将上述第2步骤中生成的 第2溶液与上述第3步骤中生成的上述第3溶液混合，生成第4溶液；第5步骤，将上述第 4步骤中生成的溶液混合到上述第1步骤中生成的第1溶液中，进行反应；以及第6步骤， 对该第5步骤中生成的混合液进行离心分离。
[0025] 在上述方式中，在上述第4步骤中被混合的上述第2溶液中的上述第2分子探针 与上述第3溶液中的上述第3分子探针可以为摩尔比1:1的比例。
[0026] 另外，在上述方式中，在上述第5步骤中，可以将上述第1步骤中生成的上述第1 溶液稀释至10倍以上后进行混合。
[0027] 另外，本发明的另一方式提供上述造影剂的制造试剂盒，其具备2个以上的收容 部以及连接这些收容部的可开闭的流路，该2个以上的收容部将第1溶液、第2溶液和第3 溶液各自分离地收容，所述第1溶液是将上述第1分子探针标记于上述基材的表面而得到 的，所述第2溶液是将上述光学探针标记于上述第2分子探针上而得到的，所述第3溶液是 将上述第1分子探针标记于上述第3分子探针上而得到的。
[0028] 发明的效果
[0029] 根据本发明，可发挥如下效果：能够容易地确认到已被纳入到细胞内。
【附图说明】
[0030]图1为示出本发明的第1实施方式的造影剂的示意性的分子结构图。
[0031] 图2为示出图1的造影剂的制造方法的流程图。
[0032] 图3示出了在培养前、撒入造影剂30分钟后图1的造影剂对CCA1高表达癌细胞 的特异性结合性，（a)为共聚焦荧光显微镜图像、（b)为亮视野图像、（c)为重叠图像；还示 出了使用不具有CCA1抗体的造影剂的比较例，（d)为共聚焦荧光显微镜图像、（e)为亮视野 图像、（f)为重叠图像。
[0033] 图4示出了在培养6小时后图1的造影剂在CCA1高表达癌细胞中的特异性细胞 内纳入，（a)为共聚焦荧光显微镜图像、（b)为亮视野图像、（c)为重叠图像；还示出了使用 不具有CCA1抗体的造影剂的比较例，（d)为共聚焦荧光显微镜图像、（e)为亮视野图像、（f 为重叠图像。
[0034]图5为示出在培养6小时后图1的造影剂在癌细胞中的特异性细胞内纳入的流式 细胞仪分析结果，（a)为CCA1高表达癌细胞的由相变纳米液滴的纳入所带来的荧光量与细 胞数的关系，（b)为（a)的各情况下的平均荧光量，（c)为内包成分不同的相变纳米液滴的 纳入所带来的荧光量与细胞数的关系，（d)为（c)的各情况下的平均荧光量。
[0035] 图6为示出用于对施与了图1的造影剂的组织进行超声波照射和摄像的实验系统 的图。
[0036] 图7为示出气相化所需强度的超声波（a)照射前、（b)照射后的超声波图像的图。
[0037] 图8为分别示出作为比较例的与图2的制造方法的步骤顺序不同的造影剂的（a) 制造方法的流程图、（b)不进行（a)的第二阶段步骤而不具有CCA1抗体的造影剂的共聚焦 显微镜分析结果、（c)纳入了也进行了第二阶段步骤、具有CCA1抗体的造影剂的情况下的 共聚焦显微镜分析结果的图。
[0038] 图9为分别示出在图2的流程图的第5步骤中（a)未稀释的情况下的散射、（b) 20 倍稀释的情况下的散射的图。
[0039] 图10为示出图1的造影剂的变形例对（a)培养前、（b)培养后的癌细胞的特异性 结合性的超声波图像。
[0040] 图11示出了在培养3小时后图1的造影剂在HCT116细胞中的特异性细胞内纳 入，（a)为共聚焦荧光显微镜图像、（b)为亮视野图像、（c)为重叠图像；还示出了使用不具 有CCA1抗体的造影剂的比较例，（d)为共聚焦荧光显微镜图像、（e)为亮视野图像、（f)为 重叠图像。
[0041] 图12示出了在培养3小时后图1的造影剂在AGS细胞中的特异性细胞内纳入，（a) 为共聚焦荧光显微镜图像、（b)为亮视野图像、（c)为重叠图像；还示出了使用不具有CCA1 抗体的造影剂的比较例，（d)为共聚焦荧光显微镜图像、（e)为亮视野图像、（f)为重叠图 像。
[0042] 图13为示出在培养12小时后图1的造影剂在HCT116细胞和AGS细胞中的特异 性细胞内纳入的流式细胞仪分析结果，（a)为示出HCT116细胞的由相变纳米液滴的纳入所 带来的荧光量与细胞数的关系的图，（b)为示出（a)的各情况下的平均荧光量的图，（c)为 示出AGS细胞的由相变纳米液滴的纳入所带来的荧光量与细胞数的关系的图，（d)为示出 (c)的各情况下的平均荧光量的图。
[0043] 图14是示意性示出本发明的一个实施方式的造影剂的制造试剂盒的图。
【具体