一种新型的甲氨蝶呤缓释、靶向碳纳米角载药体系的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属医药领域，具体涉及以新型纳米材料为载体构建的一种高效、缓释、靶向、低毒的载药体系及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤已取代心脑血管疾病成为威胁人类健康的头号杀手。传统的治疗手段存在一定缺陷，如手术治疗一般只适用于癌症早期，创伤较大并经常伴有病灶转移；放疗、化疗等方法不具有肿瘤特异性，在杀死癌细胞的同时也会杀伤正常细胞，有较大的副作用。目前亟待研发针对肿瘤治疗的新型高效低毒靶向药物。寻找更为理想的载药系统，实现更加精确的靶向治疗，提高药物体内稳定性，进一步降低其不良反应并延长作用时间，是研究人员一直努力的方向。
[0003]单壁碳纳米角(oxSWNHs)是碳纳米管的一种特殊形式，应用于载药系统给肿瘤的治疗带来新的机遇。Kasuya等研究发现单根oxSWNHs —端为封闭的锥形结构，另一端开口，正常状态下以直径为SO-1OOnm的球形聚集体存在，有很大的表面积，可达300m2/g，对药物有很强的负载能力；热稳定实验证实oxSWNHs可耐受温度为1200-1400°C，同时对酸碱耐受性也高于脂质体等其它药物载体；其外表面可以结合多种功能分子实现增溶、靶向、示踪等。Becker等于2007年实验证明了 oxSWNHs聚集体能增强渗透贮积效应(EPR)，减少药物分子被网状内皮系统的摄取(RES)，被动靶向于肿瘤组织和血管并蓄积，而且易被细胞膜通过内吞摄取。oxSWNHs优点众多，但其易聚集，水溶性差也成为其应用于医药领域时的巨大障碍。
[0004]由于oxSWNHs本身为疏水性材料，欲作为药物载体必须改善其亲水性。本发明针对单壁碳纳米角的这一缺点对其进行改造，遂引入末端氨基化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-Nh2)对其进行修饰。末端氨基化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-Nh2)为两亲性物质，其本身由两部分组成，DSPE端为疏水端，可通过- jt作用与纳米角结合，而HN2端为亲水端，易溶于水，可增强碳纳米角的水溶性。DSPE-PEG-Nh2不仅可以增强oxSWNHs的分散性，同时还可以减少网状内皮系统的非特异性摄入，延长血液中循环时间，增强生物相容性，完善oxSWNHs作为新型载药系统的属性。
[0005]甲氨蝶呤(MTX)属于叶酸拮抗剂，是以叶酸依赖性酶、胸苷酸合成酶为治疗靶点而设计合成的与这些酶的底物结构类似的化合物。它是这些正常酶底物的竞争性抑制剂，通过与酶结合而阻碍正常底物与酶的结合，从而干扰细胞中的叶酸代谢。甲氨蝶呤为抗代谢类抗肿瘤药物，属于一类抗癌药，在临床上广泛应用于白血病、成骨肉瘤、头颈部肿瘤、肺癌及乳腺癌等的化学治疗。也正是由于其作用位点多，缺乏细胞选择性，产生一些毒副作用如神经毒性、骨髓抑制、黏膜反应等，使其临床效果大打折扣。
[0006]为了弥补这一缺陷，发明人向纳米角载药体系中引入靶向剂转铁蛋白，以实现药物靶向释放。转铁蛋白(transferrin，Tf)是广泛存在于生物体液及细胞中由肝脏合成的一种单链糖蛋白家族。它含有4个带负电荷的唾液酸基因，两个三价铁离子结合位点，半衰期为8天。Tf是体液中不可缺少的成分，不仅参与铁的运输与代谢，参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节，还能调节铁离子平衡和能量平衡，更具有抗菌杀菌的保护功能。转铁蛋白主要转运血液中的铁离子，其受体在正常细胞中的表达较低，由于肿瘤细胞快速生长，对铁需求量较大，转铁蛋白受体在癌细胞表面高表达，其受体亲和力是正常细胞表面的10-100倍。转铁蛋白已被作为药物靶向剂成功的用于肿瘤的靶向治疗。
[0007]本发明以单壁碳纳米角为药物载体，装载一线抗肿瘤药物甲氨蝶呤，利用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-Nh2)改善载药体系水溶性，增加生物相容性，延长血液循环时间；引入靶向剂转铁蛋白，增加药物在病灶部位的浓度，减轻药物对正常组织的不良反应。
【发明内容】
[0008]本发明制备了缓释，低毒、靶向性强的新型碳纳米角载药体系(ΜΤΧ0oxSWNHs-PEG-Tf)。采用纳米沉淀法构建基于oxSWNHs的载药体系，装载抗癌药物甲氨蝶呤，以实现新型载药体系的载药率高、药物缓释等优点。采用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-Nh2)非共价修饰单壁碳纳米角oxSWNHs，改善其水溶性及生物相容性。选取转铁蛋白(Tf)作为靶向剂，以实现被动靶向与主动靶向相结合，使体系靶向定位病灶部位，准确释放，减少了药物对其他组织的副作用。
[0009]碳纳米载药体系MTX@oxSWNHs-PEG-Tf的制备方法如下:
[0010](I)将氧化的单壁碳纳米角oxSWNHs溶解于DMSO溶液中，超声2?4小时，制备oxSWNHs分散液I。
[0011](2)将MTX溶解于DMSO溶液中，得到MTX溶液2。
[0012](3)将分散液 I 与溶液 2 混合(oxSWNHs: MTX = I: 5 ?1: 15)优选 1: 10，搅拌12h，于12000r离心15min，弃去上清液，用DMSO与H2O混合溶液清洗沉淀后，将沉淀重新分散于去离子水中，得溶液3。
[0013](4)将DSPE-PEG-Nh2溶解于去离子水中，得到溶液4。
[0014](5)将溶液4与溶液3混合(oxSWNHs: PEG = 1: 2?1: 10)优选1: 6，搅拌l-3h，于12000r离心15min，弃上清液，得到沉淀5。
[0015](6)沉淀5用去离子水清洗2?3遍后，重新分散于去离子水中得到溶液6。
[0016](7)将转铁蛋白、1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶于去离子水中，得到溶液7、8、9。
[0017](8)混合溶液6，7，8，9，于4°C条件下反应12h，得到溶液10。
[0018](9)将溶液10，于12000r离心15min，弃上清液，分散于PH = 7.4的PBS溶液中既得到 MTX@oxSWCNH-PEG-Tf0
[0019]对于本发明的表征测试如下:
[0020](I)取适量载药体系MTX@oxSWNHs-PEG分散液(0.3mg -mL ')，进行透射电镜表征，评价纳米粒径及Zeta电位的测定，对该载药体系的微观形态及分散程度进行评价。
[0021 ] (2)取适量载药体系MTX@oxSWNHs-PEG、复合物oxSWNHs_PEG以及oxSWNHs的真空干燥样品，进行热重测试，考察MTX的载药量及PEG的修饰量。
[0022](3)对该载药体系的药物释放行为进行评价，取适量载药体系MTXOoxSWNHs-PEG分散液(0.5mg.mL ') 2mL，移入透析袋中(MW = 3500)，扎紧。置于50mL磷酸盐缓冲液(pH=5.5，含0.05%吐温-80)中，以模拟体内肿瘤环境，在100r/min的摇床中进行体外释放实验考察。在特定时间点(0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、168h)取出2mL释放介质用紫外分光光度法测定溶出液中药物浓度，且每次取出后都补充同等体积的新鲜缓冲液。以MTX溶液进行对照，根据304nm处的吸光度检测药物MTX的释放量。
[0023](4)将MAD-MB-231乳腺癌细胞接种于96孔板上，培养24h待细胞贴壁，然后加入一系列浓度的 MTX、OxSffNHs-PEG-Tf^ MTX1xSffNHs-PEG^ MTX1xSffNHs-PEG-Tf 溶液。培养24h，向每孔加入10 μ L的CCK-8溶液，培养4h，在酶标仪405nm处测定吸光度。未加入oxSWNHs和药物的细胞作为对照，计算细胞存活率。
[0024]本发明相对于现有发明，具有以下优点:
[0025](I)载药体系MTXOoxSWNHs-PEG-Tf运用纳米沉淀法载药量较高，装载的MTX的量为140?150%，即每Img单壁碳纳米角上装载了 1.5mg的药物。
[0026](2)该载药体系的平均粒径为180?210nm，粒子粒径分布集中，体系均匀，Zeta电位为-15?-19mV，电位分布集中，体系稳定分散。同时，载药体系表面带负电荷，不易与生物体内带负电荷的物质相互吸引，不具有明显的生物毒性。
[0027](3)聚乙二醇修饰碳纳米角延长了载药体系在血液中的循环时间，增强了水不溶性药物的水溶性及在血液中的稳定性。
[0028](4)载药体系与纯药相比，在O?10h载药体系具有明显的缓释效果，有效改善了纯药突释的缺点。
[0029](5)被动靶向与主动靶向相结合，进一步提高了载药体系的靶向性，通过体外细胞实验证明载药体系实现了癌症的高效低毒治疗。
[0030]综上所述，该载药体系的构建方法简明，操作简便。本发明是利用新型纳米材料单壁碳纳米角通过范德华力、疏水作用装载抗癌药物甲氨蝶呤MTX，通过31-31作用向oxSWNHs表面引入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-Nh2)，明显地改善了oxSWNHs的水溶性及在盐溶液中的稳定性，完善了 oxSWNHs作为药物载体的优越性。
【附图说明】
[0031]图1为本发明实施例5中载药体系MTX@oxSWNHs-PEG的透射电镜图。
[0032]图2为本发明实施例5中载药体系MTX@oxSWNHs-PEG的平均粒径分布图。
[0033]图3为本发明实施例5中载药体系MTX@oxSWNHs-PEG的Zeta电位表征图。
[0034]图4为本发明实施例2中MTXOoxSWNHs的热重分析图。
[0035]图5为本发明实施例5中MTX@oxSWNHs-PEG的热重分析图。
[0036]图6为本发明实施例5中原始oxSWNHs的热重分析图。
[0037]图7为本发明实施例7中载药体系MTXOoxSWNH-PEG-Tf与单纯MTX的体外药物释放曲线。
[0038]图8 为本发明实施例 8 中载药体系 MTX@oxSWNHs-PEG-Tf、MTX@oxSWNHs-PEG、MTX、oxSWNHs-PEG-Tf对M