一种多溶剂法提取和大孔树脂法富集两面针共同抗肿瘤成分的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药品和保健品领域，具体是一种多溶剂法提取和大孔树脂法富集两面针共同抗肿瘤成分的方法。
【背景技术】
[0002]两面针系芸香科花椒属植物两面针Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.的干燥根，又名蔓椒、入地金牛、双背针等，有祛风、通络、消肿、止痛之功效，主治风湿骨痛、跌打损伤、胃痛、牙痛、喉痹、瘰疬、毒蛇咬伤和汤、火烫伤等多种病症，最早以蔓椒之名记载于《神农本草经》，《中国药典》2010版收载。两面针含有多种化学成分，包括氯化两面针碱、两面针碱、白屈菜红碱、乙氧基白屈菜红碱、6-甲氧基-5，6-二氢白屈菜红碱、血根碱、α-别隐品碱、茵芋碱、木兰花碱、白鲜碱、崖椒定碱、氧化刺椒碱、鹅掌楸碱、博落回醇碱和德卡林碱等；黄酮类成分有橙皮苷、香叶木苷、牡荆素等；木脂素成分有结晶_8、L-芝麻素、L-细辛脂素、L-丁香树脂酚等；还有香豆素、萜类、醌类、留体和有机酸等。大量研究表明，氯化两面针碱、两面针碱、白屈菜红碱、6-甲氧基-5，6-二氢白屈菜红碱、乙氧基白屈菜红碱、血根碱、别隐品碱、崖椒定碱、异崖椒定碱和芝麻素等都有抗肿瘤活性。两面针碱、氯化两面针碱和别隐品碱可通过抑制拓扑异构酶I或II来抑制肿瘤细胞增殖，氯化两面针碱和芝麻素可通过控制细胞周期来抑制肿瘤细胞增殖，氯化两面针碱、白屈菜红碱和异崖椒定碱可诱导肿瘤细胞凋亡，氯化两面针碱可逆转肿瘤细胞多药耐药。因此，两面针中多种成分在肿瘤细胞增殖和凋亡的不同阶段发挥抗肿瘤作用，它们在抗肿瘤方面能发挥共同作用。中药中多种成分共同发挥整体的生物效应正是中医药治疗疾病的核心价值观。因此，把具有共同抗肿瘤作用的多种成分同时充分提取出来，可为抗肿瘤药开发、制备做准备。
[0003]在已有的两面针提取工艺研究中，尚无文献的研究目标是把共同抗肿瘤成分同时充分提取出来。近似的工艺有，雷欣潮以80%乙醇回流提取两面针3次，每次以14倍量溶剂回流lh，氯化两面针碱、乙氧基白屈菜红碱、L-芝麻素有一定的产率；陆世惠用纤维素酶、果胶酶(酶底物质量比均为1:250)于室温下(30°C)在pH5缓冲液中预处理两面针药材粉末30min，再分别用12、4和3倍量60%乙醇(含0.5%盐酸)浸渍提取3次，每次2h，总生物碱提取率85.22% ;尚有一些其他两面针提取工艺发表。所有这些工艺都存在以下不足:
[0004]第一，共同抗肿瘤的多种成分结构不同，其最适提取溶剂不同，氯化两面针碱、两面针碱、别隐品碱、6-甲氧基-5，6-二氢白屈菜红碱、乙氧基白屈菜红碱和芝麻素等宜用高浓度乙醇提取，而白屈菜红碱和血根碱等宜用低浓度乙醇提取，用相同溶剂多次提取不能把它们都充分地提取出来。
[0005]第二，提取溶剂不加酸，则抗肿瘤成分产率低；提取溶剂加酸，可以促进氯化两面针碱、白屈菜红碱、血根碱和芝麻素等抗肿瘤成分的提取，却破坏6-甲氧基_5，6- 二氢白屈菜红碱、乙氧基白屈菜红碱和别隐品碱等抗肿瘤成分的结构。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是，为了克服现有技术的不足，提供一种多溶剂法提取和大孔树脂法富集两面针共同抗肿瘤成分的方法。该方法用一种简易、经济的方法充分提取和富集两面针共同抗肿瘤成分，同时保护抗肿瘤成分不遭破坏，为抗肿瘤药的开发、制备做准备。
[0007]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0008]—种多溶剂法提取和大孔树脂法富集两面针共同抗肿瘤成分的方法，包括以下步骤:
[0009]1.药材粉碎:两面针药材清洗、切片、晒干、粉碎至粒径< 0.5?2mm ;
[0010]2.酶解预处理:药材中加入其质量3?6倍量pH 4.5?6.0醋酸-醋酸钠缓冲液，用纤维素酶、果胶酶复合酶于温度多30°C下预处理0.5?1.5h ;所述复合酶中纤维素酶、果胶酶与药材的质量比均为1:200?1:300 ;
[0011]3.中性高浓度乙醇提取与富集:经酶解预处理的药材以其质量10倍?12倍的中性高浓度乙醇用超声法、回流法或浸渍法进行第一次提取、滤过，得滤液I和滤渣1，滤液I减压回收乙醇后，上大孔树脂柱，然后用纯水清洗再用乙醇洗脱，得洗脱液I ;所述中性高浓度乙醇的体积浓度为60%?80% ;
[0012]4.酸性低浓度乙醇提取与富集:滤渣I以其质量4?8倍的酸性低浓度乙醇用超声法、回流法或浸渍法进行第二次提取、滤过，得滤液2和滤渣2，滤液2减压回收乙醇后，上大孔树脂柱，然后用纯水清洗再用乙醇洗脱，得洗脱液2 ;所述酸性低浓度乙醇是加质量浓度为0.5%?I %的盐酸或硫酸的低浓度乙醇，其体积浓度为30%?50% ;
[0013]5.酸性高浓度乙醇提取与富集:滤渣2再以其质量4?6倍的酸性高浓度乙醇用超声法、回流法或浸渍法进行第三次提取、滤过，得滤液3，滤液3减压回收乙醇后，上大孔树脂柱，然后用纯水清洗再用乙醇洗脱，得洗脱液3 ;所述酸性高浓度乙醇是加质量浓度为0.5%?I %的盐酸或硫酸的高浓度乙醇，其体积浓度为60%?80% ;
[0014]6.合并:将洗脱液1、洗脱液2和洗脱液3合并后，减压回收乙醇得浓缩液，浓缩液经干燥、粉碎，得两面针共同抗肿瘤成分混合物，混合物占步骤(I)的药材质量5%?10%，其中氯化两面针碱、白屈菜红碱、6-甲氧基-5，6-二氢白屈菜红碱、乙氧基白屈菜红碱、血根碱、别隐品碱和芝麻素等共同抗肿瘤成分占混合物质量30%?40%，用MTT法测得混合物对H印G-2肝癌细胞的半数抑制浓度为0.04?0.06mg/mL，对Hela宫颈癌细胞的半数抑制浓度为0.06?0.08mg/mL。
[0015]上述第一次提取、第二次提取和第三次提取每次提取溶剂量为药材质量的4?12倍；所述提取方法的时间:超声法超声时间为10?30min、回流法回流时间为20?40min、浸渍法浸渍时间为2?24h ;所述超声法功率为250W，频率为40KHz ;所述回流法水浴温度为90?95°C ;所述浸渍法是常温常压下浸渍。
[0016]上述大孔树脂型号为D-101或HPD-722，洗脱用3?6倍柱床体积体积浓度为60%?80%乙醇。
[0017]所述MTT法为:称取两面针共同抗肿瘤成分混合物适量，乙醇溶解后用0.22 μπι微孔滤膜过滤除菌，取滤液适量，加入RPM1-1640培养基，配制系列不同浓度两面针药液。收集对数生长期的IfepG-2肝癌细胞、Hela宫颈癌细胞，PBS洗涤后，RPM1-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度5 X 1VmL,以每孔100 μ L接种于96孔板，培养24h后加药。实验孔每孔加两面针药液100 μ L，阴性对照孔加100 μ L RPM1-1640培养基，每个浓度设5个复孔，于37.5°C、5% 0)2饱湿条件下培养48h后，小心吸弃孔内培养上清液，每孔以PBS洗I次，再将上清液吸弃。每孔加100 μ L完全RPM1-1640培养液和10 μ L MTT液(5mg/mL)，继续培养4h后小心吸去上清液，加入DMSO 150 μ L/孔，平板震荡器振荡5min，充分溶解蓝紫色颗粒，用酶标仪以570nm、630nm波长测定OD值，计算细胞增殖抑制率。抑制率=(阴性对照组OD值-实验组OD值)/阴性对照组OD值X 100 %。NOSA 2.30软件BLiss法计算半数抑制浓度。
[0018]本发明的优点是:
[0019]1、本发明先用中性高浓度乙醇提取，保护6-甲氧基-5，6_ 二氢白屈菜红碱、乙氧基白屈菜红碱和别隐品碱等抗肿瘤成分免遭酸破坏。
[0020]2、再用酸性低浓度乙醇提取，提高白屈菜红碱和血根碱等抗肿瘤成分的产率。
[0021]3、最后用酸性高浓度乙醇提取，提高两面针碱、氯化两面针碱和芝麻素等抗肿瘤成分的产率。
[0022]4、本发明多溶剂提取法和大孔树脂法交叉结合，免除滤液中和步骤，工艺更简便，使共同抗肿瘤成分的总产率最大化，总疗效最大化，开发、制备成优良抗肿瘤药的潜力巨大，市场前景好。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明进一步详细说明。但需要说明的是，实例所述工艺条件不等于本发明专利要求保护的范围。
[0024]实施例1
[0025]—种多溶剂法提取和大孔树脂法富集两面针共同抗肿瘤成分的方法，包括以下步骤:
[0026]1、药材粉碎:两面针药材清洗、切片、晒干、粉碎至粒径< 1_ ;
[0027]2、酶解预处理:药材中加入其质量4倍量pH 6.0醋酸-醋酸钠缓冲液，用纤维素酶