基于crispr的基因组修饰和调控的制作方法
【技术领域】
[0001] 本公开内容涉及靶基因组修饰。具体而言，本公开涉及RNA指导的核酸内切酶或 包含CRISPR/Cas样蛋白的融合蛋白和使用所述蛋白修饰修饰或调控靶染色体序列的方 法。
[0002] 发明背景 靶基因组修饰是用于真核细胞、胚胎和动物的基因操作的有力的工具。例如，外源序列 可以被整合在靶基因组位置和/或特定的内源染色体序列可以被缺失、失活或修饰。当前 的方法依赖于工程化核酸酶的使用，工程化核酸酶例如，锌指核酸酶（ZFNs)或转录激活子 样效应子核酸酶（TALENs)。这些嵌合核酸酶含有与非特异性DNA剪切结构域连接的可编程 的、序列特异性的DNA结合组件。但是，各个新的基因组靶需要设计包含新的序列特异性的 DNA-结合组件的新ZFN或TALEN。因此，这些用户定制设计的核酸酶往往制备昂贵且耗时。 此外，ZFNs和TALENS的特异性使得它们能介导脱靶剪切。
[0003] 因此，需要不要求针对每个新的靶基因组位置设计新的核酸酶的靶基因组修饰技 术。另外，需要特异性增加的具有很少或没有脱靶作用的技术。
[0004] 发明概沐 在本公开内容的不同方面之中提供分离的RNA指导的核酸内切酶，其中所述核酸内切 酶包含至少一个核定位信号、至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用以将 核酸内切酶靶向用于剪切的特定核苷酸序列的结构域。在一个实施方案中，所述核酸内切 酶可衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，所述核酸内切酶可经修饰而缺失至少一个功能 性核酸酶结构域。在其它实施方案中，所述核酸内切酶可进一步包含细胞穿透结构域、标 志物结构域，或二者。在进一步的实施方案中，所述核酸内切酶可以是包含指导RNA的蛋 白-RNA复合物的一部分。在一些情况下，所述指导RNA可以是包含与靶位点互补的5'区域 的单分子。也提供编码任一本文公开的RNA指导的核酸内切酶的分离的核酸。在一些实施 方案中，所述核酸可以是针对在哺乳动物细胞（例如，人细胞）中翻译而最优化的密码子。 在其它实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶的核酸序列可以与启动子控制序列可操作 性地连接，并任选地可以是载体的一部分。在其它实施方案中，包含可以与启动子控制序列 可操作性地连接的编码RNA指导的核酸内切酶的序列的载体也可包含可以与启动子控制 序列可操作性连接的编码指导RNA的序列。
[0005] 本发明的另一方面包括用于在真核细胞或胚胎中修饰染色体序列的方法。该方法 包括向真核细胞或胚胎中引入（i)至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸 内切酶或编码至少一种如本文所定义的RNA指导的核酸内切酶的核酸，（ii)至少一种指导 RNA或编码至少一种指导RNA的DNA，和任选（iii)至少一种包含供体序列的供体多核苷 酸。该方法进一步包括培养所述细胞或胚胎以便各指导RNA将RNA指导的核酸内切酶定向 至染色体序列中的靶位点，其中所述RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入所述靶位点， 并且所述双链断裂通过DNA修复过程而修复以便修饰染色体序列。在一个实施方案中，所 述RNA指导的核酸内切酶可以衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，编码引入细胞或胚胎 中的RNA指导的核酸内切酶的核酸可以是mRNA。在进一步的实施方案中，其中编码引入细 胞或胚胎的RNA指导的核酸内切酶的核酸可以是DNA。在进一步的实施方案中，编码RNA指 导的核酸内切酶的DNA可以是另外包含编码指导RNA的序列的载体的一部分。在某些实施 方案中，所述真核细胞可以是人细胞、非人哺乳动物细胞、干细胞、非哺乳动物的脊椎动物 细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞或单细胞真核生物。在某些其它实施方案中，所述胚胎是 非人单细胞动物胚胎。
[0006] 本公开内容的另外方面提供包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域的 融合蛋白。一般而言，所述融合蛋白包含至少一个核定位信号。融合蛋白的效应子结构域 可以是剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。在一个实 施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自Cas9蛋白。在一个重复中，所述Cas9 蛋白可经修饰而缺失至少一个功能性核酸酶结构域。在备选的重复中，所述Cas9蛋白可以 被修饰而缺失全部核酸酶活性。在一个实施方案中，所述效应子结构域可以是剪切结构域， 例如，FokI核酸内切酶结构域或修饰的FokI核酸内切酶结构域。在另一实施方案中，一种 融合蛋白可与另一融合蛋白形成二聚体。所述二聚体可以是同源二聚体或异源二聚体。在 另一实施方案中，所述融合蛋白可与锌指核酸酶形成异源二聚体，其中融合蛋白和锌指核 酸酶二者的剪切结构域是FokI核酸内切酶结构域或修饰的FokI核酸内切酶结构域。在仍 另一实施方案中，所述融合蛋白包含衍生自经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白的 CRISPR/Cas样蛋白，并且所述效应子结构域是FokI核酸内切酶结构域或修饰的FokI核酸 内切酶结构域。在仍另一实施方案中，所述融合蛋白包含衍生自经修饰而缺失全部核酸酶 活性的Cas9蛋白的CRISPR/Cas样蛋白，并且所述效应子结构域可以是表观遗传修饰结构 域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。在另外的实施方案中，本文公开的融合蛋白中任 一种可包含至少一个选自核定位信号、细胞穿透结构域和标志物结构域的另外的结构域。 也提供编码本文提供的融合蛋白中任一种的分离的核酸。
[0007] 本公开内容的仍另一方面包括用于在细胞或胚胎中修饰染色体序列或调控染色 体序列的表达的方法。所述方法包括向细胞或胚胎中引入：(a)至少一种融合蛋白或编码 至少一种融合蛋白的核酸，其中所述融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子 结构域，和（b)至少一种指导RNA或编码至少一种指导RNA的DNA，其中所述指导RNA将融 合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白指导至染色体序列中的靶位点，并且融合蛋白的效应子结构 域修饰染色体序列或调控染色体序列的表达。在一个实施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/ Cas样蛋白可以衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋 白可经修饰而缺失至少一个功能性核酸酶结构域。在仍另一实施方案中，所述融合蛋白的 CRISPR/Cas样蛋白可经修饰而缺失全部核酸酶活性。在其中融合蛋白包含经修饰而缺失全 部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域的一个实施方案 中，该方法可包括向所述细胞或胚胎引入一种融合蛋白或编码一种融合蛋白的核酸和两种 指导RNA或编码两种指导RNA的DNA，并且其中一个双链断裂被引入染色体序列。在其中 所述融合蛋白包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切结构域或修饰的 FokI剪切结构域的另一实施方案中，所述方法可包括向所述细胞或胚胎中引入两种融合蛋 白或编码两种融合蛋白的核酸和两种指导RNA或编码两种指导RNA的DNA，并且其中两个双 链断裂被引入所述染色体序列。在其中所述融合蛋白包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的 Cas9蛋白和FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域的仍另一实施方案中，所述方法可 包括向细胞或胚胎中引入一种融合蛋白或编码一种融合蛋白的核酸、一种指导RNA或编码 一种指导RNA的核酸和一种锌指核酸酶或编码一种锌指核酸酶的核酸，其中所述锌指核酸 酶包含FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域，并且其中一个双链断裂被引入所述染 色体序列。在其中所述融合蛋白包含剪切结构域的某些实施方案中，所述方法可进一步包 含向细胞或胚胎引入至少一种供体多核苷酸。在其中所述融合蛋白包含选自表观遗传修饰 结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域的效应子结构域的实施方案中，所述融合蛋 白可包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白，且所述方法可以包括向细胞或胚胎 中引入一种融合蛋白或编码一种融合蛋白的核酸和一种指导RNA或编码一种指导RNA的核 酸，并且其中修饰所述靶染色体序列的结构或表达。在某些实施方案中，所述真核细胞可以 是人细胞、非人哺乳动物细胞、干细胞、非哺乳动物的脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物 细胞或单细胞真核生物。在某些其它实施方案中，所述胚胎是非人单细胞动物胚胎。
[0008] 本公开内容的其它方面和重复在下面详述。
[0009] 附图简沐 图1图示使用蛋白二聚体的基因组修饰。（A)描绘了由两种融合蛋白组成的二聚体所 产生的双链断裂，所述两种融合蛋白的每一种包含用于DNA结合的Cas样蛋白和FokI剪切 结构域。（B)描绘了由二聚体所产生的双链断裂，所述二聚体由包含Cas样蛋白和FokI剪 切结构域的融合蛋白以及包含锌指（ZF) DNA-结合结构域和FokI剪切结构域的锌指核酸酶 组成。
[0010] 图2表明使用包含基因调控结构域的RNA指导的融合蛋白调控基因表达。（A)描 绘了包含用于DNA结合的Cas样蛋白和激活或抑制基因表达的"A/R"结构域的融合蛋白。 (B)图示包含用于DNA结合的Cas样蛋白和通过邻近的DNA或蛋白的共价修饰而影响表观 遗传状态的表观遗传修饰结构域（"Epi-mod'）的融合蛋白。
[0011] 图3图示使用两种RNA指导的核酸内切酶的基因组修饰。
[0012] (A)描绘了由已经转化为切口酶的两种RNA指导的核酸内切酶产生的双链断裂。 (B)描绘了由具有核酸内切酶活性的两种RNA指导的核酸内切酶产生的两个双链断裂。
[0013] 图4显示了用Cas9核酸、Cas9指导的RNA和AAVS1-GFP DNA供体转染的人K562 细胞的荧光激活细胞分选术（FACS)。Y轴表示在红色通道的自发荧光强度，和X轴表示绿 色荧光强度，（A)用以下转染的K562细胞：10吨的用Anti-Reverse帽类似物转录的Cas9 mRNA、0. 3 nmol 的预退火的 crRNA-tracrRNA 双链体和 10 吨的 AAVS1-GFP 质粒 DNA ; (B) 用以下转染的K562细胞：10 Pg的用Anti-Reverse帽类似物转录的Cas9 mRNA、0. 3 nmol 的嵌合RNA和10吨的AAVS1-GFP质粒DNA ; (C)用以下转染的K562细胞：10吨的通过 转录后加帽反应加帽的Cas9 mRNA、0. 3 nmol的嵌合RNA和10吨的AAVS1-GFP质粒DNA ; (D)用10吨的Cas9质粒DNA、5吨的U6-嵌合RNA质粒DNA和10吨的AAVS1-GFP质粒 DNA转染的K562细胞；（E)用10吨的AAVS1-GFP质粒DNA转染的K562细胞；（F)仅用转 染试剂转染的K562细胞。
[0014] 图5显示证明GFP靶向整合至人细胞的AAVSl基因座的连接PCR分析。泳道M: 1 kb DNA分子标记；泳道A:用以下转染的K562细胞：用Anti-Reverse帽类似物转录的10 Kg 的 Cas9 mRNA、0. 3 nmol 的预退火的 crRNA-tracrRNA 双链体和 10 Kg 的 AAVS1-GFP 质 粒DNA ;泳道B:用以下转染的K562细胞：用Anti-Reverse帽类似物转录的10吨的Cas9 mRNA、0. 3 nmol的嵌合RNA和10吨的AAVS1-GFP质粒DNA ;泳道C:用通过转录后加帽反 应加帽的10吨的Cas9 mRNA、0. 3 nmol的嵌合RNA和10吨的AAVS1-GFP质粒DNA转染 的K562细胞；泳道D:用10吨的Cas9质粒DNA、5吨的U6-嵌合RNA质粒DNA和10吨 的AAVS1-GFP质粒DNA转染的K562细胞；泳道E:用10吨的AAVS1-GFP质粒DNA转染的 K562细胞；泳道F:仅用转染试剂转染的K562细胞。
[0015]发明详沐 本文提供RNA指导的核酸内切酶，其包含至少一个核定位信号、至少一个核酸酶结构 域和至少一个与指导RNA相互作用以将所述核酸内切酶靶向用于剪切的特异性核苷酸序 列的结构域。也提供了编码RNA指导的核酸内切酶的核酸，和使用RNA指导的核酸内切酶 修饰真核细胞或胚胎的染色体序列的方法。所述RNA指导的核酸内切酶与特异性的指导 RNA相互作用，所述特异性的指导RNA的每一种将所述核酸内切酶定向至特定靶位点，在所 述位点该RNA指导的核酸内切酶引起双链断裂，其可通过DNA修复过程而修复使得修复染 色体序列。因为特异性通过所述指导RNA提供，因此基于RNA的核酸内切酶是通用的，并且 可以与不同的指导RNA-起使用以靶向不同基因组序列。本文公开的方法可用于靶向和修 饰特定的染色体序列和/或将外源序列引入到细胞或胚胎的基因组中的靶位置。此外，靶 向是特异性的，具有有限的脱靶效果。
[0016] 本公开内容提供了融合蛋白，其中融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和 效应子结构域。合适的效应子结构域包括但不限于剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录 激活结构域和转录抑制子结构域。通过特异性指导RNA将各融合蛋白指导至具体的染色体 序列，其中所述效应子结构域介导靶基因组修饰或基因调控。在一个方面，所述融合蛋白可 用作二聚体，从而增加靶位点的长度和增加其在基因组中的唯一性的可能性（从而，降低 脱靶效果）。例如，内源的CRISPR系统基于大约13-20 bp的DNA结合字长度而修饰基因组 位置（Cong等人，Science, 339:819-823)。在此字长，仅5-7%的靶位点在基因组内是唯 一的（Iseli等人，PLos One 2(6):e579)。相比之下，锌指核酸酶的DNA结合字长范围通 常为30-36 bp，这产生大约85-87%在人基因组内唯一的靶位点。基于CRISPR的系统所利 用的较小大小的DNA结合位点限制了在所需位置附近的基于靶向CRISP的核酸酶的设计并 使其复杂化，所述所需位置例如疾病SNPs、小外显子、起始密码子和终止密码子，以及在复 杂的基因组中的其它位置。本公开内容不仅提供了用于扩展CRISPR DNA结合字长的方式 (即，以便限制脱靶活性），而且进一步提供具有修饰功能性的CRISPR融合蛋白。因此，所 公开的CRISPR融合蛋白具有增加的靶特异性和唯一的功能性。本文也提供使用融合蛋白 以修饰或调控靶染色体序列的表达的方法。
[0017] (I) RNA指导的核酸内切酶 本公开内容的一个方面提供包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶，所述 核定位信号允许核酸内切酶进入真核细胞和胚胎（例如，非人单细胞胚胎）的胞核。RNA指 导的核酸内切酶也包含至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用的结构域。 RNA指导的核酸内切酶被指导RNA定向至特定的核酸序列（或革EU立点）。所述指导RNA与 RNA指导的核酸内切酶和靶位点相互作用使得一旦定向至靶位点，RNA指导的核酸内切酶 就能够向靶位点核酸序列中引入双链断裂。因为所述指导RNA提供针对靶向剪切的特异 性，RNA指导的核酸内切酶的核酸内切酶是通用的并且可以与不同指导RNA -起使用以剪 切不同靶核酸序列。本文提供了分离的RNA指导的核酸内切酶、编码RNA指导的核酸内切 酶的分离的核酸（即，RNA或DNA)、包含编码RNA指导的核酸内切酶的核酸的载体、以及包 含RNA指导的核酸内切酶加上指导RNA的蛋白-RNA复合物。
[0018] RNA指导的核酸内切酶可衍生自成簇的规律间隔的短回文重复（CRISPR)/CRISPR 相关的（Cas)系统。CRISPR/Cas系统可以是类型I、类型II或类型III系统。合适的CRISPR/ Cas 蛋白的非限制性实例包括 Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e (或 CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、 Cas7、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、 Csy3、Csel (或 CasA)、Cse2 (或 CasB)、Cse3 (或 CasE)、Cse4 (或 CasC)、Cscl、Csc2、 Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、 Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Cszl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4 和 Cul966。
[0019] 在一个实施方案中，RNA指导的核酸内切酶衍生自类型11 CRI SPR/Cas系 统。在特定实施方案中，RNA指导的核酸内切酶衍生自Cas9蛋白。Cas9蛋白可来自酿 {Streptococcus pyogenes) ^ ^ ^ {Streptococcus thermophilus)> 链球菌57?.)、达松维尔拟诺卡氏菌KiUei)、 始旋链霉菌、绿色产色链霉菌（tSYre1/?細 )、绿色产色链霉菌、玫瑰链抱囊菌（tSYre1/?、玫 瑰链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌（Wi、假蕈状芽孢杆菌 {Bacillus pseudomycoides) ^Bacillus selenitireducens^Exiguohacterium sihiricum^ 德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、 M ^ ^{Microscilla marina)>Burkholderiales bacterium、Polaromonas naphthalenivorans>Polaromonas sp.、Crocosphaera watsonii、奮奸餐{Cyanothece职）、铜绿微囊蓝细菌胤紹)、聚球菌职）、阿拉伯 {Acetohalobium arabaticum) ^ Ammonifex degensiu Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus Desulforudis、與毒後舊{Clostridium botulinuni)、娘後 菌（C/astri、大芬戈尔德菌（/7Zne^rWia 、嗜热盐碱厌氧菌 {Na tranaerohi us thermophi I us)> M ? 5 ^ ^{Pelo tomaculum thermoprop i oni cum)> Acidithiobacillus caldus、^%後氧M览银MiVi:着[{Acidithiobacillus ferrooxidan^)、紫色硫细菌、海杆菌57?.)、嗜盐硝化球 菌(Ni trosococcus halophilus、、Ni trosococcus watsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、多鱼{Anabaena {Nodularia spumigena) ^Nostoc57?. {Arthrospira maxima) ^ Arthrospira platens{Arthrospira57?.)、鞘丝蓝细菌属57?.)、原型体微鞘蓝细菌 颤蓝细菌属（(?以Vhtoria职）、非洲栖热腔菌（TXe/TffosipAc*africanus)或Acaryochloris marina。
[0020]