一种猪圆环病毒灭活疫苗与猪细胞因子联合免疫方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种免疫方法，特别设及一种猪圆环病毒灭活疫苗与猪细胞因子的联 合免疫方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒病（PCVD)是由猪圆环病毒2型（PCV2)引起的猪传染性疾病，除引 发断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMW巧外，还可导致母猪繁殖障碍、猪皮炎肾病综合征 (PDNS)、新生仔猪先天性震颤（CT)、增生性坏死性肺炎（PN巧和肠炎等疾病，同时也是引发 猪呼吸道病综合征（PRDC)的原发病原之一。该病在我国的阳性率呈逐年上升的趋势，具有 流行范围广、各生长阶段猪感染严重、混合感染突出等特点，是近几年我国发生流行的多病 原多因素的"无名高热综合征"中的主要因素之一，已成为制约当今养猪业稳定、发展的头 号杀手，严重威胁我国养猪业的发展。商品化PCV灭活疫苗的应用给我国PCVD的防治带来 积极的意义，但猪圆环病毒2型灭活疫苗在规模猪场使用后免疫效果不确实。如何提高和 改善猪圆环病毒2型疫苗的免疫效果己成为当今免疫研究领域和预防兽医实践的重要课 题和研究热点。
【发明内容】
[0003] 本发明针对W上缺点，提供一种猪圆环病毒灭活疫苗与猪细胞因子联合免疫方 法，W达到提高和改善猪圆环病毒2型疫苗的免疫效果的目的。
[0004] 为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现： 阳〇化]一种猪圆环病毒灭活疫苗与猪细胞因子联合免疫方法，所述联合免疫方法为同时 注射猪圆环病毒灭活疫苗与猪细胞因子，其中猪细胞因子为IL-4,比-2,4联用，猪基因工 程干扰素和猪转移因子中的一种。
[0006] 进一步，所述猪细胞因子为IL-4,比-2,4联用，和猪转移因子中的一种。
[0007] 进一步，所述猪细胞因子为猪转移因子。
[0008] 进一步，小猪14日龄和28日龄分别注射PCV2灭活疫苗1血W及比-2,40. 1血。
[0009] 进一步，小猪13-15日龄，当天与后14天分别注射PCV2灭活疫苗1头份和25万 IU的比-4。
[0010] 进一步，小猪14日龄和28日龄，颈部肌肉注射PCV2灭活疫苗1ml，另侧颈部肌肉 注射猪基因工程干扰素。 1] 进一步，小猪14日龄和28日龄经颈部肌肉注射免疫，分别肌注PCV2灭活疫苗1血 与猪用转移因子0.ImL。
[0012] 总之，本发明的有益效果为：
[0013] 本发明的联合免疫方法白细胞介素2,4与PCV2灭活疫苗联合免疫能显著提高仔 猪细胞免疫水平；IL-4与PCV2灭活疫苗联合使用，能显著降低仔猪的发病率和死亡率，提 高仔猪平均日增重和饲料报酬，显著提高经济效益。重组猪干扰素与PCV2灭活疫苗联合使 用能提高仔猪的成活率、降低仔猪的发病率，提高PCV2疫苗免疫后的抗体水平；转移因子 与PCV2灭活疫苗联合免疫能缩短免疫空白期，提高免疫效果，降低发病率。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。 阳〇1引 实施例1
[0016] IL-2,4与猪PCV2灭活疫苗联合应用试验
[0017] 试验方法：
[0018] 试验选用遗传背景相近、14日龄"杜X长X大"立元杂交健康仔猪60头，随机分 成2组，每组3个重复，每个重复10头猪。常规饲养管理，自由采食和自由饮水。试验组于 14日龄和28日龄注射PCV2灭活疫苗1血+比-2,40. 1血，对照组于14日龄和28日龄注射 PCV2灭活疫苗1血。
[0019] 试验第21、35、49d分别于各组随机选取4头仔猪（公母各半）前腔静脉采集血液 2份，1份2血注入无菌青霉素小瓶中，加入肝素钢抗凝，用于血液淋己细胞转化试验。1份 用乙二胺四乙酸二钟巧DTA-K2)抗凝管采血山以用于血细胞分类计数。
[0020] 在试验第28、42d清晨，各组随机选取4头仔猪（公母各半），称重后屠宰，屠宰前 在自由饮水条件下禁食2地。颈静脉放血，开膛剖取腹股沟淋己结、颂下淋己结、肝脏、脾脏 和胸腺，并剔除上面的结缔组织，用于检测各免疫器官指数。
[0021] 实验结果：
[0022]IL-2,4对仔猪免疫器官指数的影响
[0023] 表1IL-2,4对仔猪免疫器官指数的影响
[0024]
[00巧]研究结果见表明，试验28d(42日龄）时，试验组仔猪腹股沟淋己结指数、颂下淋 己结数、肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数分别比对照组高9. 64%、15. 04%、7. 23%、22. 79% 和19. 23 %，其中脾脏指数和胸腺指数差异显著（P< 0. 05)，其他几个免疫器官指数差异 不显著（P>0.05);试验42d(56日龄）时，试验组仔猪腹股沟淋己结指数、颂下淋己结 指数、肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数分别比对照组高18. 58%、20. 59%、2. 68%、35. 04% 和18. 96%，其中肝脏指数差异不显著（P> 0. 05)，其他各免疫器官指数差异均显著（P < 0. 05)，说明IL-2,4与PCV2灭活疫苗联合免疫能提高仔猪的免疫力。对照组和试验组仔 猪56日龄时各免疫器官指数均比42日龄要高，说明PCV2灭活疫苗免疫后仔猪第42d的免 疫力比第28d更强。
[0026] 2.IL-2,4对仔猪淋己细胞转化率的影响
[0027] 表2IL-2,4对仔猪淋己细胞转化率的影响
[0028]
[0029] 试验结果显示，试验组不同日龄淋己细胞转化率均显著高于对照组（P< 0. 05)。 表明IL-2,4能增强细胞免疫活性。
[0030] 3.IL-2,4对仔猪外周血细胞分类计数的影响
[0031] 表3白细胞介素对仔猪外周血细胞分类计数的影响
[0032]
[0034] 试验结果表明，比-2,4与PCV2灭活疫苗联合免疫比单独使用PCV2灭活疫苗免疫， 35d和49d时外周血白细胞数量和淋己细胞数量显著增加（P< 0. 05)，红细胞和中性粒细 胞数量有上升的趋势，但无显著影响（P> 0. 05)。 阳035] 白细胞介素2,4与PCV2灭活疫苗联合免疫能显著提高仔猪细胞免疫水平：比-2， 4与PCV2联合免疫仔猪腹股沟淋己结指数、颂下淋己结指数、肝脏指数、脾脏指数和胸腺指 数均高于显著高于单独使用PCV2灭活疫苗；比-2,4与PCV2联合免疫淋己细胞转化率均显 著高于单独使用PCV2灭活疫苗；比-2,4与PCV2联合免疫外周血白细胞数量和淋己细胞数 量比单独使用PCV2灭活疫苗显著增加。说明IL-2,4与PCV2灭活疫苗联合免疫能有效促 进仔猪的细胞免疫功能，提高仔猪的免疫力。
[0036] 实施例2
[0037] IL-4与猪PCV2灭活疫苗联合应用试验 阳0測试验方法：
[0039] 选择13-15日龄、体重相近、遗传背景相同的杜长大杂交仔猪120头，随机分为3 组，每组内设4个重复，每个重复10头。试验各组于试验开始当天与试验后14d分别注射 PCV2灭活疫苗1头份+猪白细胞介素-4(IL- 4) 25万IU、PCV2灭活疫苗1头份和生理盐 水1血。
[0040] 在上述免疫试验结束后，再选择13-15日龄仔猪633头开展大群试验。试验猪随 机分成2组，一组注射PCV2灭活疫苗1头份+IL- 425万IU，另一组只注射PCV2灭活疫 苗1头份不注射白细胞介素，间隔14d重复免疫一次，记录91日龄体重、饲料消耗、发病率 和成活率。
[0041] 实验结果；
[0042] 表4IL-4+PCV2灭活疫苗免疫对仔猪生产性能的影响
[0043]
W44] 试验结果表明，试验开始（14日龄）至第一阶段结束巧6日龄），IL-4联合PCV2 灭活疫苗免疫仔猪平均日增重为378. 6g，分别比单独用PCV2灭活疫苗免疫和不用疫苗提 高11. 98%和25. 20%，差异显著（P< 0.05)。试验开始（14日龄）至第二阶段结束巧1日 龄），IL- 4联合PCV2灭活疫苗免疫仔猪平均日增重为529. 9g，比单独用PCV2灭活疫苗免 疫提高6.26%，差异不显著（P>0.05)，比不用疫苗提高17. 60%，差异显著（P< 0.05)。 随着仔猪日龄的增大，两种免疫方法对仔猪平均日增重的影响在缩小。
[0045] 91日龄时，IL- 4联合PCV2灭活疫苗免疫仔猪发病率为21. 49%，比单独用PCV2 灭活疫苗免疫下降26. 18%，差异显著（P< 0. 05)，比不用疫苗下降52. 24%，差异极显著(P< 0. 01)。IL- 4联合PCV2灭活疫苗免疫仔猪试验期死亡率为5 %，分别比单独用PCV2 灭活疫苗免疫和不用疫苗下降33. 33%和60%，差异极显著（P< 0. 01)。
[0046] 整个试验期IL- 4联合PCV2灭活疫苗免疫仔猪料重比为2. 06,比单独用PCV2灭 活疫苗免疫降低6. 79%，差异不显著（P> 0. 05)，比不用疫苗降低24. 82%，差异极显著（P < 0. 01)。
[0047] 按表中说明毛利润的计算方法，试验期IL- 4联合PCV2灭活疫苗免疫每头仔猪 毛利润比单独用PCV2灭活疫苗免疫多38. 9元，比不免疫组多赚132. 90元。说明仔猪用猪 圆环病毒疫苗免疫时配合猪白细胞介素使用，能给猪场带来更多的经济效益。
[0048] 表5PCV疫苗+IL-4大群免疫试验结果
[0049]
[0050]PCV疫苗联合IL- 4大群免疫试验结果表明，IL- 4联合PCV2灭活疫苗免疫仔猪 成活率为94. 22 %，比单独用PCV2灭活疫苗免疫提高2. 95个百分点，平均日增重提高36邑， 料重比降低0. 12,与小群试验结果基本一致。
[0051] IL- 4联合PCV2灭活疫苗免疫仔猪平均日增重比单独用PCV2灭活疫苗免疫提高 6. 26% -11. 98%，仔猪料重比降低6. 79%，仔猪试验期死亡率下降33. 33%，每头仔猪毛利 润增加38. 9元。说明仔猪用猪圆环病毒疫苗免疫时配合猪白细胞介素使用，能给猪场带来 更多的经济效益。白细胞介素（IL)作为疫苗免疫佐剂近年来国内外有较多的研究，但未有 IL-4与PCV2灭活疫苗联合使用的研究。本研究探明IL-4能成为猪PCV2疫苗新型高效的 免疫增强剂，促进PCV2感染的免疫防治。IL-4与PCV2灭活疫苗联合使用，能显著降低仔猪 的发病率和死亡率，提高仔猪平均日增重和饲料报酬，显著提高经济效益。 阳0巧 实施例3
[0053] 猪基因工程干扰素与PCV2灭活疫苗联合应用试验
[0054] 试验方法： 阳化日]14日龄仔猪60头随机分成A、B、C、D四组，每组15头。处理组与对照组均于14 日龄和28日龄颈部肌肉注射PCV2灭活疫苗1ml/头，但处理组同时于另侧颈部肌肉注射猪 基因工程干扰素，A组剂量为50万活性单位、B组25万活性单位、C组12. 5万活性单位，D 组为空白对照，不注射猪基因工程干扰素。
[0056]ELISA测定抗体各组分别于首免疫后第1如、2W、28d和35d前腔静脉采血，进行 PCV2抗体检测。血清样品中的PCV2抗体检测按世纪元亨公司猪圆环病毒2型抗体酶联免 疫诊断试剂盒的说明书进行操作，其判断标准为：P> 0. 6,N《0. 15时，S/P> 0. 25,被检 样品为PCV2抗体阳性；S/P< 0. 25,被检样品为PCV2抗体阴性。
[0057] 中和抗体检测各组分别于首免疫后第1如、