单链抗体及其相关成套抗肿瘤试剂与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中单链抗体及其相关成套抗肿瘤试剂与应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤的细胞免疫治疗倾向于使自体效应细胞能够重新祀向肿瘤细胞，由于T 淋己细胞在抗原特异性细胞免疫反应中的关键作用及它们具有记忆能力，从而使其成为研 究的热点。人一旦患上恶性疾病，就说明其自身免疫系统已经不能够针对肿瘤细胞进行及 时而有效的杀灭，但是研究表明，机体的免疫系统也不是毫无作为，例如T淋己细胞在许多 肿瘤组织中有浸润运种现象就是一个明证，但是遗憾的是它们常常不能对恶性瘤细胞发动 攻击，虽然对恶性肿瘤缺乏免疫监控的原因目前仍不甚清楚，但是一般认为是由于大多数T 淋己细胞识别的抗原是没有变异的分化抗原，一般来讲，肿瘤细胞本身为免疫反应提供的 祀位很少。综合目前的研究成果，肿瘤的出现可W从肿瘤与免疫系统之间相互作用的分析 中得出W下几种原因，简单地说，有瘤细胞积极的免疫逃逸机制，如肿瘤细胞的免疫原性弱 及抗原调变，肿瘤细胞表面缺乏MHCI类分子，使CTL不能识别肿瘤细胞表面的抗原，W致瘤 细胞得W逃脱宿主的免疫攻击；持续的但是无效的免疫反应，如肿瘤细胞表面的抗原被封 闭，特异性抗体被肿瘤的游离抗原中和，肿瘤抗原变异；恶性瘤细胞的免疫忽略，如肿瘤抗 原作用于处于不同阶段的特异性淋己细胞，可W使幼稚的淋己细胞接触肿瘤抗原后诱发免 疫耐受。由于W上运些复杂的原因导致了肿瘤的出现，所W-个有效的抗癌免疫治疗必须 克服上述障碍W便有效地激活T淋己细胞去祀向攻击瘤细胞。到目前为止，大部分免疫治 疗方法都是设计将效应细胞如CTLs直接祀向肿瘤细胞。然而诱导有效的抗肿瘤反应，抗体 和效应细胞必须从循环中渗出浸润到肿瘤部位才能杀伤肿瘤细胞，但因为肿瘤内的高间质 压，使得浸润到肿瘤部位的抗体分子和效应细胞非常少。肿瘤血管是恶性肿瘤生长及转移 的基础，W肿瘤血管为治疗祀点，抑制肿瘤血管的形成或破坏已经形成的肿瘤血管，可W阻 断肿瘤细胞的营养来源和迁移路径，因此抗肿瘤血管治疗成为肿瘤治疗的重要策略之一。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了成套抗肿瘤试剂。 阳0化]本发明所提供的成套抗肿瘤试剂，为下述M或N:
[0006] M、包括单链抗体和效应细胞的成套抗肿瘤试剂；
[0007] 所述单链抗体其名称为SCAB,由下述甲、乙、丙和下的蛋白质连接而成：
[0008] 甲、序列表中SEQIDNo. 1的第37-161位氨基酸所示的蛋白质；
[0009] 乙、序列表中SEQIDNo. 1的第177-289位氨基酸所示的蛋白质；
[0010] 丙、序列表中SEQIDNo. 1的第305-424位氨基酸所示的蛋白质；
[0011] 下、序列表中SEQIDNo. 1的第440-546位氨基酸所示的蛋白质；
[0012] 所述效应细胞为T淋己细胞或PMBC;
[0013] N、包括与所述单链抗体相关的生物材料和所述效应细胞的成套抗肿瘤试剂；
[0014] 与所述SCAB相关的生物材料，为B1)至B。）中的任一种：
[0015] B1)编码所述SCAB的核酸分子；
[0016] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0017] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
[0018] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0019] B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
[0020] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0021] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0022] B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
[0023] B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
[0024] B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
[0025] B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0026] B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。
[0027] 为了使所述SCAB便于纯化，可在序列表中SEQIDNo. 1的第37-546位氨基酸所 示的蛋白质的氨基末端或簇基末端连接上如表1所示的标签。
[00測表l、t不签的序列
[0029]
[0030] 所述SCAB可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述SCAB 的编码基因可通过将SEQIDNo. 2或SEQIDNo. 2的第109-1641位核巧酸所示的DM序 列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/ 或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。 阳03U 上述成套抗肿瘤试剂中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DM或重组 DNA;所述核酸分子也可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0032] 上述成套抗肿瘤试剂中，B2)所述的含有编码所述SCAB的核酸分子的表达盒 (SCAB基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达SCAB的DNA，该DNA不但可包括启动SCAB 基因转录的启动子，还可包括终止SCAB基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括 增强子序列。
[0033] 可用现有的表达载体构建含有所述SCAB基因表达盒的重组载体。
[0034] 上述成套抗肿瘤试剂中，所述载体可为质粒、黏粒、隧菌体或病毒载体。
[0035] 上述成套抗肿瘤试剂中，所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到 pET28a(+)中得到的重组载体。在本发明的一个实施例中，B3)所述重组载体为将所述 SCAB的编码基因（核巧酸序列为序列表中SEQIDNo. 2的第109-1641位核巧酸）导入 pET28a(+)中得到的重组载体祀T28a-SCAB，重组载体祀T28a-SCAB表达沈QIDNo. 1所示 的SCAB。
[0036] 上述成套抗肿瘤试剂中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。
[0037] 上述成套抗肿瘤试剂中，所述转基因动物细胞系、所述转基因动物组织和所述转 基因动物器官均不包括繁殖材料；所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入到大肠杆 菌化21 0E3)中得到的重组微生物。
[0038] 本领域普通技术人员可W很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的B1)所述SCAB的核巧酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发 明的B1)所述SCAB的核巧酸序列75%或75%W上同一性的核巧酸，只要编码所述SCAB且 具有SCAB活性，均是衍生于本发明的核巧酸序列并且等同于本发明的序列。
[0039] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQIDNo. 2的第109-1638位核巧酸序列或SEQIDNo. 2的核巧酸序列具有75% 或更高，或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用 肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分 比（％ )表示，其可W用来评价相关序列之间的同一性。
[0040] 上述75%或75%W上同一性，可为75%、80%、85%、90%或95%^上的同一性。
[0041] 上述成套抗肿瘤试剂中，所述SCAB为下述a)或b):
[0042] a)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo. 1的第37-546位氨基酸的抗体；
[0043] b)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo. 1的抗体。
[0044] 其中，SEQIDNo. 1的第5-10位氨基酸为His-tag的氨基酸序列；SEQIDNo. 1的 第37-161位氨基酸为所述甲的氨基酸序列，SEQIDNo. 1的第177-289位氨基酸为所述乙 的氨基酸序列，SEQIDNo. 1的第305-424位氨基酸为所述丙的氨基酸序列，SEQIDNo. 1 的第440-546位氨基酸为所述下的氨基酸序列，SEQIDNo. 1的第162-176位氨基酸、第 290-304位氨基酸和第425-439位氨基酸均为连接肤的氨基酸序列。
[0045] 上述成套抗肿瘤试剂中，编码所述甲的核巧酸序列为序列表中SEQIDNo. 2的第 109-483位核巧酸；
[0046] 编码所述乙的核巧酸序列为序列表中SEQIDNo. 2的第529-867位核巧酸；
[0047] 编码所述丙的核巧酸序列为序列表中SEQIDNo. 2的第913-1272位氨基酸； W48] 编码所述下的核巧酸序列为序列表中SEQIDNo. 2的第1318-1638位核巧酸。
[0049] 上述成套抗肿瘤试剂中，B1)所述核酸分子为下述1)或2)或3)或4):
[0050] 1)核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0051] 2)核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 2的第109-1638位核巧酸的cDNA分子或 DNA分子；
[0052] 3)与1)或2)限定的核巧酸序列具有75%或75%W上同一性，且编码所述SCAB 的cDNA分子或基因组DM分子；
[0053] 4)在严格条件下与1)或2)限定的核巧酸序列杂交，且编码所述SCAB的cDNA分 子或基因组DNA分子。
[0054] 其中，SEQIDNo. 2由1647个核巧酸组成，SEQIDNo. 2的第1-1641位核巧酸编 码沈QIDNo. 1所示的单链抗体SCAB。
[0055] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQIDNo. 2的第109-1638位核巧酸序列或SEQIDNo. 2的核巧酸序列具有75% 或更高，或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用 肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分 比（％ )表示，其可W用来评价相关序列之间的同一性。
[0056]