包含dna甲基化抑制剂的常染色体显性多囊肾改善或治疗用药学组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是设及改善常染色体显性多囊肾疾病的药学组合物，其特征在于该组合物 包含DNA甲基化抑制剂。
【背景技术】
[0002] 常染色体显性多囊肾（Autosomaldominantpolycysticki化巧disease:ADP邸） 发病率是每500-1000名中至少有1名的较常见遗传病。常染色体显性多囊肾与健康的 人相比较时两边肾脏会形成较多充满液体的囊肿，肾脏会大4-8倍为特点。目前为止因 没有有效的多囊肾临床治疗方法大部分的多囊肾病会发展成终末期肾病（Gabow，1993 ; Grantham, 1996)。人类多囊肾中囊肿的形成伴随着囊肿的表皮细胞的细胞繁殖、增加及细 胞的自我灭亡。
[0003] 尽管W常染色体显性方式遗传，但常染色体显性多囊肾的特征是个别囊肿的形 成W病灶的（focal)、散发（sporadical)性质，管状表皮细胞中只有1-5 %才会形成囊肿 (Qian,etal.，1996)。近来的研究提出了常染色体显性多囊肾囊肿形成对2-mT模型的 强有力的证据。在老鼠的囊肿发育时W全部的化dl对立基因的损耗为需要（Jiang,et al.，2006)。在人类常染色体显性多囊肾中往往观察到异型结合性化eterozygosity)损 耗或者P邸1的附带细胞质的突变度adenas，etal.，2000;BrasierandHenske，1997; Koptides,etal. , 1998 ;Pei,etal. , 2001 ;Qian,etal. , 1996)。不仅如此，因人类P邸 1 突 变被诱导的囊肿显示出肾脏表皮分化基因表达损耗及与有丝分裂信号传导路径关联的基 因集反常的向上调整（Songetal. 2009)。但是其他研究结果是利用受遗传形变的小鼠模 型显示野生型Pkdl表现标准减少在肾脏中可W诱导囊肿形成化eeuwen，etal.，2004)。运 样的结果显示在多囊肾对个别囊肿形成必要的因子未充分披露，像表观遗传（epigenetic) 形变的另一个分子式机制干扰囊肿的形成。
[0004] 据悉表观遗传（epigenetic)形变是各种各样的疾病发生的主要原因。例如肿瘤 细胞是包含全体表观基因组（epigenome)的染色体结构中显示出广泛的变化，与细胞再生 关联的全部路径会受到表观遗传的调整障碍（JonesandBaylin，2007)。近来几项研究 结果是表观遗传的突变与包括常染色体显性多囊肾的肾脏发病相关，变化的表观遗传的 因子的可逆恢复使副作用最小化且对治疗肾脏疾病成为强有力的方法化i，2011 ;Park，et al., 2011a;VasyutinaandTreier, 2010)。然而，还没有对全体表观基因组或常染色体显 性多囊肾关联的DNA甲基化剖面法（profiling)分析。
[0005] 虽然目前为止研制了很多多囊肾治疗药品，但是因负面反馈的阻碍得到了失望的 临床结果。
【发明内容】
[0006] 发明要解决的问题
[0007] 本发明是W提供对常染色体显性多囊肾疾病更有效的药剂组合物为目的的。
[000引解决问题的技术方案
[0009] 本发明人是从多囊肾患者及未受多囊肾困扰的人的肾脏组织中分析了整个基因 组的甲基化状态。此分析是利用甲基化-CpG-结合域（Methylated-CpG-bindingDomain; MBD)蛋白质亲和柱的利用依存于甲基化DM存储MIRA-seq(甲基化CpG岛meth}dated-CpG islandrecoveryassaywithparallelsequencing)执行后为了确定及定量精炼的 碎块做了深度排序。再者，本发明人对不同的甲基化的基因表达变化做了实验，表观遗 传沉默（epigeneticsilencing)是抑制细胞输送、结合及细胞分化的主要路径，即通过 微阵列的分析说明干预Notch,Wnt及mTOR信号传导路径的基因中的重要性。特别是本 发明人发现与非多囊性患者相比多囊性患者的PKD1基因体会超甲基化。此超甲基化 (hypermethylation)诱导MBD蛋白质的结合运是指P邸1基因的表观遗传沉默干预肾脏囊 肿的发育。体外（invitro)囊肿形成模型是DNA甲基化抑制剂有效的清除了表观遗传沉 默表现出对囊肿形成的抑制性，常染色体显性多囊肾进行中确定了运类的表观遗传的机制 的作用。本发明人掲示了全体基因组连接的甲基化状态变化和多囊肾的囊肿形成之间的关 系，运认为是在多囊肾治疗中可W应用。
[0010] 发明的效果
[0011] 本发明人实验结果表明与离子传导和细胞结合关联的PKD1及其他基因在基因体 的部分被超甲基化，他们的表现在多囊肾患者的肾脏组织中向下调整。特别是PKD1在多囊 肾基因体部分被超甲基化运与MBD2(methy；L-CpG-bindingdomain2)蛋白质结合有关联。 不仅如此DNA甲基化抑制剂的处理是伴随PKD1表现的向上调整且延迟MDCK(狗肾传代细 胞，Madin-DarbyCanineKi化ey)细胞的囊肿形成。
[001引 因此，本发明如利用DNA甲基化抑制剂可W压制P邸1基因体的超甲基化，W此来 掲示常染色体显性多囊肾的治疗与改善的可能性。
【附图说明】
[001引图1是确认非多囊肾和多囊肾肾脏组织中被选择的基因表达标准。（A)基因体部 分中表现完全不同的甲基化标准的基因的表现标准W定量的实时RT-PCR来确认。利用了 非多囊肾（n= 3)和多囊肾（n= 5)的肾脏组织。被选择的基因的DNA甲基化标准是对催 化剂和基因体部分WMIRA-seq分析用CMES来表示。被选择的Notch/Wnt/mTOR信号传导 路径基因集中基因表达及DNA甲基化发生了变化。度）基因本体组：表现传送（SLC6A19)， 巧信号（CACNA化LAT)，形态形成（SA化1，C0L6A3)，组蛋白形变。各条形的高度表 示平均值，误差条形表示+标准偏差。P-肌动蛋白被利用为内部对照群。实验各进行了 3 次。P<0. 05,GB:基因体（gene-body),PR(p;romote;r):引物。
[0014] 图2是表现P邸1基因体部分的超甲基化与其表现调整有关联。（A)P邸1DNA甲基 化概况（profiles)WdCMES图来表示。度）总甲基化质量是W3人的非多囊肾及7-8人 的多囊肾患者的基因体及引物的探针中CpG部位附近的甲基化标准的百分比（W焦憐酸测 序决定）相加来计算（A的红色箭头）。（08人的多囊肾患者样本（赤色圆）和3人的非 多囊肾肾脏样本（青色圆）中表现PKD1表现和基因体DNA甲基化之间的关系。值）表示 囊肿表皮细胞中PKD1基因体甲基化和表现标准消极的相关关系。WT9-12细胞中脱甲基酶 5-aza-dC处理时（2iiM和4iiM，72小时期间）有代表性的PKDl基因体（探针1)及引物CpG岛部位（探针2)的DM甲基化变化W重亚硫酸盐焦憐酸测序来确认。用定量实时RT-PCR 显示PKDlmRNA标准由5-aza-dC处理恢复。各条形的高度表示平均值，误差条形表示+标 准偏差。P-肌动蛋白被利用为内部对照群。虽然PKD1基因体甲基化标准因5-aza-dC的 处理恢复了一点，但是会对PKD1基因表达有所影响。两次实验均执行了S次。P<0. 05。 [001引图3是DNA甲基化抑制剂处理对体外囊肿形成表现抑制性。（A)DNA甲基化抑制 剂5-aza-dC2yM及折布拉林（zeb) 100yM来处理的MDCK细胞是在3D胶原凝胶中培养 10日。MDCK细胞中囊肿形成是从第4日开始。虽然对照群细胞囊肿内腔变大，但是在处理 DNA甲基化抑制剂的细胞中时就不一样了。做囊肿内腔大小的扩张是在9-10日期间显微 镜3个领域（field)中随机选择的31-38个MDCK细胞中测定。***，P<0. 001(C)第10日 5-aza-dC及W折布拉林（zebularine)的处理P邸1基因体部位中DNA甲基化清除W3次焦 憐酸测序来确定。P<0. 05值)3DMDCK细胞培养液中因DNA甲基化抑制剂的处理DNA脱甲基 恢复了P邸1基因表达。P邸1表现标准是定量的实时RT-PCR(S次）来测定，将P-肌动蛋 白利用为内部装载（loading)对照群而标准化。***，P<0. 001。
[0016] 图4是表示P邸1超甲基化部位诱导MBD2和抑制组蛋白标记物的结合。（A)P邸1 基因体部位中表现MBD2的积累。W3D培养的MDCK细胞核提取物来指示的基因部位中执 行MBD2及MECP2ChIP-qPCRs。度）表示从化1-5'UTR中分化的MECP2的积累。（C)从甲基 化的CGI部位中表现MBD2的积累。核提取物在刚开始是W化nP1来传送取得未甲基化的 CGI分划，剩余沉淀分划是WMspI稍微切断来得到甲基化的CGI分划。各CGIDNA分划使用 RT-qPCR的模板。为了定量利用了WigG对照群对化IP-qPCR的比率。值）W犬Mbd2为目 标的siRNA妨碍了 3D-培养的MDCK细胞中P邸ImRNA的标准下降。对照群及犬Mbd2siRNA 是W15nM浓度为MDCK细胞中转染48小时。P-肌动蛋白被利用为内部对照群实验各进行 了 3次。**，P<0. 01似犬Mbd2siRNA在被转染的细胞中对照群SiRNA被转染的细胞相比较 使囊肿形成减少。犬Mbd2siRNA和对照群SiRNA在MDCK细胞中转染，处理毛喉素巧iiM)后 6日期间执行了 3D培养。囊肿内腔大小是在第六天在显微镜视野中随机选择的46-48MDCK 细胞中测定。***，P<〇. 001 (巧被指示的组蛋白抗体及WPCR引物位置在MDCK细胞的PKD1 基因体部位中执行组蛋白化IP-qPCR。Y轴表示与未经处理的对照群比较的5-aza-dC处理 群的PKDlmRNA标准的比例。所有的实验反复实施了 3次W上。
[0017] 图5是表示从肾细胞癌和多囊肾