用于治疗和/或预防再狭窄的药物制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明大体上设及用于在需要其的受试者中治疗和/或预防再狭窄的药物制剂。 还提供治疗和/或预防的方法。
【背景技术】
[0002] 每年全世界有3000万W上的患者进行开放式外科血管重建，所述开放式外科血 管重建被定义为使用移植物改善身体部位或器官的血液供应。不幸的是，5年内20-50%的 病例发生移植物失效，运主要由于吻合位点处的狭窄导致闭塞[1]。
[0003] 在血管内介入的情况中，已确定医疗器械（例如支架或普通气囊）在预防管腔内 血管狭窄方面具有有前景的效果。然而，当开放式血管重建是强制性的时，没有可用的平台 用于局部药物递送。目前的开放式血管重建后的治疗意味着具有副作用风险的反复口服给 予活性化合物。
[0004] 为了通过避免发生狭窄而增加再灌注的可能性，在手术部位应用局部（local)预 防性治疗将比全身用药更加安全和有效。为了有效，局部治疗需要保持定位于用药部位并 根据通过病理学发展确定的最佳时间表递送药物。运样的制剂还需要是生物相容的和可生 物降解的，其经水解或酶解而被消除，避免二次手术移除该药物递送装置。此外，它应该W 小体积递送，对人类约5ml，并且不应该损伤移植物或周围组织。 阳0化]尽管已经在动物模型中测试了血管周给药途径，但是该方法的成功是有限的。迄 今，市场上仍然没有临床应用。运种有限的成功的原因在于可行性限制。到目前为止，还没 有使用生物相容的和可生物降解的聚合物用于预防性治疗开放式外科血管重建后的再狭 窄且具有适合病理学发展的最佳药物释放特性的制剂在患病部位实现长期局部持久性。
[0006] 通过提供本发明的用于在需要其的受试者中治疗和/或预防再狭窄的药物制剂， 本发明已经实现了运些目标。
【附图说明】
[0007]图1:根据IH的发展，具有最佳释放动力学特性的本发明的图示。使快速递送的 对急性炎症期有效的本发明的化合物或其任何活性代谢物负载到水凝胶中，并在再狭窄发 展的早期释放。由于水凝胶的固有粘度，其将确保药物递送系统的局部化持续需要的时间。 负载于微球中的对再狭窄的后期有效的本发明的第二化合物或其任何活性代谢物，将W持 续的方式释放，例如在本图中释放长达4周。
[000引图2 :从渗有ATV的水凝胶中的释放动力学。将不同量的阿托伐他汀（ATV)渗入 水凝胶（2. 5yM、5yM、10yM)中。对所有的样品，ATV在12小时内从水凝胶中释出。水凝 胶的保留作用是可忽略的。未观察到=个不同浓度之间的释放特性的显著差异（t-检验， P> 0. 0f5)。
[0009] 图3 :从水凝胶中释放的ATV降低人血管平滑肌细胞化VSMC)的活力。如通过MTT 试验所评价的，hVSMC的活力被5-10iiMATV显著降低，不论药物被直接加入培养基质（培 养基）或由水凝胶（凝胶）释放。运个变化在IOyMATV(24h)存在下比在5yMATV(7化） 存在下更快，相比在ATV不存在下培育的各细胞（对照）而言，*P< 0. 05。
[0010] 图4 :渗有ATV的水凝胶减少hVSMC的迁移（migration)。
[0011] 上图：使用画出了~500ym的不含细胞的间隙（线）的娃培养基插入物（silicon 州；L^reinsert)评价原代hVSMC的迁移速率。在对照条件（对照培养基）下生长的hVSMC 迁移进入此间隙并在约4她内将其填满。此迁移被5和10yMATV减少，不论药物被直接 加入培养基（ATV培养基）或由水凝胶（ATV凝胶）释放。棒代表80ym。 阳01引下图：ATV被直接加入培养基时（左图），在5yMATV存在下在36h时观察到细胞 迁移的抑制，在IOiiMATV存在下在24h时就已经观察到细胞迁移的抑制。使用负载ATV 的水凝胶观察到类似的hVSMC迁移的抑制（右图）。相比不存在ATV时培育的对照细胞而 言，女P< 0. 05,女女P< 0. 01。
[0013] 图5 :渗有ATV的水凝胶减少移行（transmigration)。
[0014] 上图：采用改良的Boyden室技术评价ATV存在或不存在时hVSMC的移行。
[0015] 下图：移行的细胞的定量评价证明在ATV存在于培养基中或由水凝胶释放时显 著降低hVSMC移行的能力。相比不存在ATV时培育的对照细胞而言，*P< 0. 05、* *P <0.Ol和***?<0. 001。棒代表 20ym。
[0016] 图6 :hVSMC的转录物和蛋白质的分析。在被直接加入培养基的ATV存在下进行 hVSMC中各mRNA水平的测量。培育24小时之后，PAI-1、MMP2和Cx43mRNA的水平降低，而 tPA和HMOX转录物增多。当ATV从水凝胶释出时，在24h时未观察到显著变化。相反，在从 水凝胶释出的ATV存在下，在48小时后观察到测试基因的类似调控。相比没有ATV培育的 细胞（对照）而言，*P< 0. 05、* *P< 0.Ol和 * * *P< 0. 001。
[0017] 图7 :负载阿托伐他汀的PLGA微球及其截面的扫描电子显微照片。微球是球形的、 光滑的，平均粒径为10ym(左图），具有实屯、的内部结构（右图）。
[0018] 图8 :来自负载于微球中的ATV和/或渗入凝胶中的游离ATV的ATV累积释放（上 图）和非累积释放（下图）。通过调整颗粒和凝胶负荷而将制剂中ATV的总量保持恒定为 Img/ml。命名：G-M+:渗入水凝胶中的负载ATV的微球，G+M-:渗入水凝胶中的游离ATV和 不含药物的微球，G+M+ :渗入水凝胶中的游离ATV和负载ATV的微球。包封阿托伐他汀的微 球的存在显著延缓从制剂中的释放。
[0019] 图9 :在渗入水凝胶中的负载ATV的颗粒和/或游离ATV的存在下内膜增生（IH) 的发展减缓。
[0020] 上图：经历CAL模型的WT小鼠的颈动脉的代表性横截面的显微照片 (Verhoeff-vanGieson弹性蛋白染色）（放大率X10)。使用未处理的小鼠作为对照。所 有被处理的小鼠都接受总的恒定的ImM的ATV浓度，ATV在水凝胶中似和/或在负载（+) 或未负载（-)的微球中（M)，例如在G+M+的情况下，G+ = 500yM并且M+ = 500yM，而在 G-M+的情况下，G- :0mM并且M+ =ImM。
[0021] 中图：初步的结果表明，相比WT对照小鼠，手术后第14天和28天时，采用负载ATV 的微球处理的动物的内膜厚度显著减小。 阳0巧下图：第14天（左图）和28天（右图）时，在距结扎位点不同距离处所显示的内 膜/中膜比（I/M)的定量评价证明，与对照相比，在ImM负载ATV的微球的存在下，在结扎 后第14和28天时，结扎的颈动脉的内膜/中膜比在距结扎0. 5、1、I. 5和2mm处减小。 阳02引 图10:ATV从负载ATV的微球中的延长释放动力学。此批微球是采用聚值，k丙 交醋-共-乙交醋HResomerRG503)制备的。释放持续长达52天。
[0024]图11 :ATV和阿司匹林（ASA)从渗入水凝胶中的负载ATV的微球和游离ASA的释 放动力学。该凝胶包含400ygASA每ml水凝胶和Img包封于微球中的ATV每ml水凝胶。 命名：Gas:渗入水凝胶中的游离ASA，GMat:渗入水凝胶中的负载ATV的微球，GasMatASA: 渗入水凝胶中的游离ASA和负载ATV的微球，ASA的结果，GasMatATV:渗入水凝胶中的游离 ASA和负载ATV的微球，ATV的结果。ASA在2天内快速释放，而ATV甚至在4周后仍然释 放。
[00巧]图12 :负载紫杉醇（PT讶的RG503微球的光投射显微照片，所述微球的平均粒径 为 29Jim。
[0026]图13 :PTX和阿司匹林（ASA)从渗入水凝胶中的负载PTX的微球和游离ASA的释 放动力学。该凝胶包含400ygASA每ml水凝胶和4mg包封于微球中的PTX每ml水凝胶。 命名：Gas:渗入水凝胶中的游离ASA，GMpa:渗入水凝胶中的负载PTX的微球，GasMpaASA: 渗入水凝胶中的游离ASA和负载PTX的微球，ASA的结果，GasMpaPTX:渗入水凝胶中的游 离ASA和负载PTX的微球，PTX的结果。在运些加速的释放条件下，ASA在4天内完全释放， PTX的释放持续10天。 阳〇八]发巧概沐
[0028] 本发明提供用于在需要其的受试者中治疗和/或预防再狭窄的药物制剂，所述药 物制剂存在于凝胶相中，所述凝胶相包含
[0029] i)至少一种快速递送的对急性炎症期有效的化合物或所述至少一种化合物的任 何活性代谢物，和
[0030] ii)持续释放制剂，其包含至少一种对再狭窄发展后期有效的化合物或所述至少 一种化合物的任何活性代谢物。
[0031] 还公开了在需要其的受试者中治疗和/或预防再狭窄的方法，所述方法包括给予 存在于凝胶相中的药物制剂，所述凝胶相包含i)至少一种快速递送的对急性炎症期有效 的化合物或所述至少一种化合物的任何活性代谢物，和ii)持续释放制剂，其包含至少一 种对再狭窄发展后期有效的化合物。
[0032] 本发明还提供了用于治疗和/或预防再狭窄的试剂盒，其包含用于在需要其的受 试者中治疗和/或预防再狭窄的药物制剂，所述药物制剂存在于凝胶相中，所述凝胶相包 含i)至少一种快速递送的对急性炎症期有效的化合物或所述至少一种化合物的任何活性 代谢物，和ii)持续释放制剂，其包含至少一种对再狭窄发展后期有效的化合物或所述至 少一种化合物的任何活性代谢物。
【发明内容】
[003引超急性阶段由现存的真正的内膜衬里的损伤启动。hVSMC(人血管平滑肌细胞）的 增殖通过两种机制（包括损伤的内皮细胞和hVSMC增殖）开始。急性阶段的特征为血栓的 形成、内皮细胞向内生长和生长因子的释放。在此阶段，损伤后数小时至数周，细胞外基质 巧CM)的完整性受到影响，运刺激hVSMC从中膜迁移至内膜巧]。在内膜增生（IH)的第S