Salipro颗粒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及脂蛋白颗粒，其用作疏水试剂（如疏水性药物或膜蛋白）的递送或载 体系统，本发明还设及用于制备该盘状脂蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 膜蛋白和疏水性的化合物非常难W处理，并且制药和生命科学研究和应用中具 有两个主要的挑战：（i)为不可溶的疏水化合物或膜蛋白提供在水溶液中的可溶性，W及 (ii)将运类疏水性物质作为治疗剂和诊断剂施用。
[0003] 膜蛋白由全部ORF的大约30%编码（参见文献"WallinandvonHeiJne,Protein Science1998Apr;7 (4) : 1029-38")，并且由于大部分（即，大于60% )药物实际上革己向 运类蛋白，因此其代表了一类重要的药物祀点（参见文献"Overingtonetal.，化化re ReviewsDrugDiscovery5, 993-996(December2006)")。膜蛋白在许多生物过程中发挥 重要作用，如信号转导、分子和能量运输、识别和细胞通讯。然而，当将膜蛋白从其天然脂双 层环境中提取出来后，膜蛋白由于其不溶性和趋于聚集的性质而难W研究。为了维持膜蛋 白的完整性，需要人造的疏水环境。在此，去垢剂胶束是最常使用的，然而其会对生物相容 性产生负作用，能够对膜蛋白的活性产生不利影响，并且可能会干扰检验的实验条件。
[0004] 另一个主要的药理学挑战是，施用和递送疏水性化合物和/或疏水性蛋白作为治 疗剂或诊断剂。由于运些疏水性试剂的溶解度有限，它们趋于聚集，运将导致局部药物颗 粒浓度高，从而会导致高的毒性、不希望的免疫反应，并且会使药物失活（参见文献"Allen andCullis,SCIENCE, 303 (5665) :1818-1822,MAR19,2004")。
[0005] 因此，非常需要将诸如膜蛋白、药物或诊断化合物等疏水试剂纳入可溶性的颗粒 中的应用。目前，解决运两个挑战的方法主要设及脂质体和重组高密度脂蛋白（r皿L)颗粒 (参见文献"QianandBoxer,QirrentOpinioninchemicalBiology11:1-7, 2007")。
[0006]EP1596828B1公开了盘状生物活性试剂运送颗粒，包含W双带样形式紧密包围脂 双层的载脂蛋白。上述颗粒的内部由脂双层的疏水区域形成。运与具有含水内部的封闭球 状双层壳的脂质体不同。EP1596828B1中公开的盘状生物活性试剂运送颗粒的斯托克斯直 径约为IOnm,并且提出了将其用作疏水性药物如两性霉素B或喜树碱的递送载体。
[0007]EP1345959B1公开了相似类型的直径约10皿、高度约5. 5皿的纳米颗粒。该颗粒 为盘状，并且由（i)人工膜脚手架蛋白、（ii)憐脂双分子层和（iii)至少一种疏水性或部 分疏水性膜蛋白组成。所述膜脚手架蛋白也W双带样式包围脂双层，并且是人载脂蛋白A-I 的衍生物或截短形式，缺少人载脂蛋白A-I的N-末端球状结构域，其是两亲性的并且形成 至少一个a螺旋，并且在水环境中会与憐脂或憐脂的混合物自组装成所述盘状的纳米颗 粒。运种工程化的膜脚手架蛋白（MS巧将为纳米级盘状脂蛋白颗粒提供稳定性、尺寸均匀 性W及有用的功能性。
[0008] 然而，目前可用的纳米盘技术存在一些缺点，例如，在颗粒的组装过程中需要去除 去垢剂。除此之外，在现有技术的方法中，由载脂蛋白衍生的MSP的紧密双带样形式提供的 尺寸均匀性似乎导致了运样的代价：固定的最小颗粒尺寸，和限制了可获得的最大直径。
[0009] 銷脂激活蛋白（saposin)家族包括4种小（大约80个氨基酸）蛋白，包括銷脂激 活蛋白A到D，其与脂结合和/或相互作用，并且在銷脂代谢中作为一些溶酶体酶的重要辅 因子（参见"化化n，BiochemJ. (2005) 389, 249-257"和其所引用的文献）。据描述，銷脂激 活蛋白更偏好带负电荷的脂质和低抑值，在酸性抑环境中显示出明显提高的活性，最佳抑 值为溶酶体内4. 75的抑值。銷脂激活蛋白A、B、C和D由单一的大的前体蛋白銷脂激活 蛋白原（prosaposin)通过蛋白水解作用水解而得。已经报道了銷脂激活蛋白A、B、C和D 的完整氨基酸序列、化及銷脂激活蛋白原的基因组结构和CDNA序列（请参见"0'化ienet al. (1988)Science241, 1098-1101 !F^irst等（1992)BiochimBio地ysActa1126:1-16")。
[0010] 銷脂激活蛋白C在酸性环境中能够诱导含憐脂的载体发生膜融合（参见 "ArchivesofBiochemistryandBiophysics2003Jul1;415(1) :43-53"),其他銷脂激 活蛋白没有表现出该特征。文献"Qietal. (2009)ClinCancerRes15(18):5840 - 5851" 报道了銷脂激活蛋白C偶联的二油酷基憐脂酷丝氨酸纳米载体（SapC-DOP巧，其具有含水 内部、大约190nm的平均直径，并且在体内表现出肿瘤祀向活性。在SapC-DOPS中，銷脂激 活蛋白C或其衍生肤作为其结合的脂质体的导向肤化omingP巧tide)。銷脂激活蛋白C而 后祀向脂质体到细胞膜外叶暴露有憐醋酷丝氨酸的癌细胞。作者认为，由于溶酶体酶的细 胞外泄漏而导致的癌细胞周围的独特酸性微环境使得肿瘤组织成为銷脂激活蛋白C的最 佳祀标。根据Qi等人所述，SapC-DCPS溶酶体通过W下方法制备：在N2(g)下干燥溶剂溶 解的憐脂，将干燥的憐脂分散在含有纯化的銷脂激活蛋白C的酸性缓冲液（pH5)中，在生 理水溶液中将混合物稀释50倍，W及通过后续的超声处理促进纳米载体组装。
[0011]文献叩opovicetal. ,PNAS,Vol. 109,No. 8 (2012) 2908-2912"报道了銷脂激活蛋 白A去垢剂盘的结构。銷脂激活蛋白AW可溶的、脂/去垢剂-结合的状态存在。在脂质 缺乏时，銷脂激活蛋白A采取封闭的无配体（apo)构象。相反，Popovic等报道的銷脂激活 蛋白A去垢剂盘结构显示了开放构象的銷脂激活蛋白A的两条链，其包裹了 40个内部结合 的去垢剂分子，它们被组织在高度有序的双层样疏水核屯、中。
[0012] 除了銷脂激活蛋白A去垢剂盘的结晶作用，Popovic等还描述了可溶性脂-銷脂激 活蛋白A复合物的制备，其在4. 75的抑下通过需要多步的方法进行。首先，通过如下方式 制备均匀级分的大单层脂质体载体：在N2(g)下干燥用氯仿溶解的脂质，通过满旋混合将干 燥的脂质分散在酸性缓冲液巧OmM乙酸钢抑4.8,150mM化Cl)中，对悬浮液进行10个冻 融循环，在满旋混合器中混合5分钟，将混合物挤压通过200nm过滤器。在酸性缓冲液中将 由此制备的大单层脂质体载体与纯化的銷脂激活蛋白A混合，由此获得可溶的脂质-銷脂 激活蛋白A颗粒。该颗粒表现出窄的尺寸分布，即，大约平均3. 2nm的流体动力学（斯托克 斯）半径，并且每个銷脂激活蛋白A链含有大约5:1的脂质分子。颗粒的精确大小仅适度 地受到脂质与蛋白的摩尔比W及脂质体的组成的影响。无论在脂质体混合物中是否存在阴 离子憐脂、胆固醇或銷糖脂，作者均观察到了相似的3. 2nm的颗粒。在所有情况下，在3. 2nm 斯托克斯半径的尺寸范围内观察到了单一的峰，运提示了相对窄的种类分布。因此，该文献 公开的技术限制于4. 75的抑值、上述颗粒大小W及包括繁复的上游脂质体制备步骤。
[0013] 在该背景下，需要一种可靠且易于实施的制备稳定的特定脂蛋白-颗粒组合物的 方法，W使膜蛋白和其他疏水化合物溶液化。考虑到现有技术中所公开的用于制备盘状脂 蛋白颗粒的方法费事且具有多个步骤，因此尤其具有运样的需求。
[0014] 多种疏水试剂能够潜在地从现有技术中记载的载脂蛋白-或銷脂激活蛋白A-衍 生的纳米盘技术中获益。然而，由于銷脂激活蛋白A衍生颗粒具有3. 2nm大小的限制，似乎 (如果有的话）只有小分子可W在其中所公开的酸性抑值下被纳入所述颗粒。尽管体积大 的疏水化合物和大的生物分子如（寡聚）膜蛋白能够被纳入现有技术中的载脂蛋白A衍生 的纳米盘，但是可行的最大直径仍然受到运些颗粒的双带样载脂蛋白A的周长的限制。此 夕F，IOnm的载脂蛋白A衍生纳米盘对于某些应用而言可能过大。因此，需要先进的纳米盘技 术和更优的具有灵活可控的尺寸范围的脂蛋白颗粒，使得能够适应待被纳入脂蛋白颗粒中 的疏水试剂的各自的尺寸。运样的颗粒应当可W简单地整合膜蛋白和其他疏水组分，所述 其他疏水组分例如可W为具有药学或生物学活性的化合物或诊断化合物。
【发明内容】
[0015] 本发明所要解决的问题是提供一种纳米级脂蛋白颗粒，其大小可控和/或其大小 适应于被纳入的分子的性质，并且其易于制备并且随着时间的推移能够保持均一的大小、 品质和组成。
[0016] 该问题通过运样的颗粒而得W解决，该颗粒包含脂质结合多肤、至少一种脂质和 一种疏水试剂，其中所述疏水试剂不同于所述至少一种脂质，并且其中所述脂质结合多肤 是銷脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式。
[0017] 本发明还提供了一种药物组合物或诊断用组合物，其包含本发明所述的颗粒。
[0018] 本发明还提供了用于制备包含脂质结合多肤和脂质的颗粒的方法，其中所述脂质 结合多肤为銷脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式，并且其中所述方法包括W下步 骤：在液体环境中使所述脂质结合多肤与溶液化的脂质接触；并且在抑值为5. 0-10下使 得自组装成所述颗粒。
[0019] 最终，本发明所述颗粒能够作为疏水试剂递送载体、作为药物研发、药物筛选、膜 蛋白研究的工具、W及作为疫苗接种制剂。
[0020] 不限于此理论，疏水试剂与脂质W及銷脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式 的结合看来提供了坚固的结构，其在广泛抑范围（特别是生理抑值）的水性溶液中稳定 存在，并且使得能够获得比现有技术中3. 2nm的銷脂激活蛋白A衍生的脂蛋白颗粒更大的 颗粒。本发明所述的颗粒是通过本发明的方法获得的，该方法在抑5.0至10下操作，运样 使得能够自组装成本发明所述的颗粒。
[0021] 能够通过本发明所述方法获得的銷脂激活蛋白类蛋白-脂蛋白颗粒（本文称为 "Salipro颗粒"）在多个特征上与现有技术中的颗粒不同，例如，它们具有内在的尺寸可变 性，并且能够适应于待被纳入脂蛋白颗粒中的疏水试剂的各自的尺寸。
[0022] 与銷脂激活蛋白-脂蛋白颗粒应当在或接近于銷脂激活蛋白的最佳4. 75的天然 抑值下进行最佳的组装的预期不同，发现在制备銷脂激活蛋白-脂蛋白颗粒的过程中，保 持更加中性或碱性的抑能够获得具有改进的性能和更广的应用范围的銷脂激活蛋白-脂 蛋白颗粒。令人惊讶的是，发现在抑从5. 0到10W及存在溶液化的脂质时，纯化的銷脂激 活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式自组装成稳定的脂蛋白颗粒，而不需要繁琐的上游脂 质体制备步骤。当尝试在銷脂激活蛋白的最优4. 75的天然抑下或者在缺乏脂质下进行颗 粒的组装时，该简单且可靠的制备方法不能获得满意的结果。
[002引本发明所述Salipro颗粒被证明在生理抑值下能够纳入各种脂质、膜蛋白和疏水 化合物，从而产生在水性环境中可溶且稳定的纳米复合物。
[0024] 本发明所述Salipro颗粒在经受标准离屯、过滤单元进行浓缩、W及冷冻和解冻时 是坚固的。此外，实际实验表明本发明所述Salipro颗粒展现出一定程度的热稳定性。除 此之外，可W对本发明所述颗粒进行冷冻干燥、储存和再水化，而不会观察到任何大的品质 劣化。
【具体实施方式】
[0025] 脂质结合多肤是銷脂激活蛋白类蛋白（SAPLI巧或其衍生物或截短形式。本文 所用的术语"銷脂激活蛋白类蛋白"（SAPLI巧是本领域熟知的，并且包括脂质相互作用蛋 白的銷脂激活蛋白类蛋白（SAPLI巧家族的所有成员。SAPLIP家族的特征是具有銷脂激 活蛋白折叠，其为通过高度保守的分子内二硫键保持稳定的保守的a螺旋=维结构（参 见文献"Munford等.（1995)，JournalOf LipidResearch,vol. 36,no. 8, 1653 - 1663" 和"Bruhn(2005)，BiochemJ389(15) :249 - 257")。本发明所述的銷脂激活蛋白类 蛋白（SAPLIF0 家族的成员的例子在文献"Munfordetal. (1995),JournalofLipid Research,vol. 36,no. 8, 1653 - 1663"和"化uhn(2005)，BiochemJ389 (15) : 249 - 257"中 有所描述，在此通过引用的方式将其全部内容并入本文。
[002引在无配体（即，无去垢剂/无脂质）的"封闭"状态下，SAPLIP采取单体紧凑四 螺旋束型结构，即，銷脂激活蛋白折叠。该折叠可W列举W下结构：人脂激活蛋白A的封闭 无配体形式的结构（蛋白数据库（PDB)ID编号：2D0B，参见"Ahnetal. (2006)Protein Sci.l5:1849-1857")或銷脂激活蛋白C的结构（PDBID编号：lM12;参见"deA化aet al. (2003)Biochemist巧 42, 14729 - 14740")、NK-细胞溶素的结构（PDBID编号：INKL;参 见"Liepinshetal. (1997)化t.Struct.Biol. 4, 793 - 795")、阿米己穿孔素A(amoebapore A)的结构（PDBID编号：10F9)和颗粒溶素（granulysin)的结构（PDBID编号：1L9L;参 见"Andersonetal. (2003)J.Mol.Biol. 325, 355 - 365")，它们的结构均几乎相同并且易 于重叠（super-impos曰ble)。
[0027] SAPLIP在结合至配体（例如脂质或去垢剂分子）后发生构象变化。在配体结合 "开放"构象中，SAPLIP采取V形或飞旋标形构象，暴露出与所结合的脂质接触的疏水表 面。该开放构象可列举W下结构：现有技术中的銷脂激活蛋白A去垢剂盘结构（PDB ID编 号：4孤J ;参见叩opovic等.，PNAS, Vol. 109, No. 8 (2012) 2908-2912")、和结合至SDS去垢 剂胶束的銷脂激活蛋白C的结构（PDB ID编号：1SN6 ;参见"Hawkins et al. (2005)J.M〇1. Biol. :346:1381-1392")。
[0028] 在本发明的颗粒中，脂质结合多肤优选为两亲性的，其结构的一部分或多或少是 亲水的并且面向水性溶剂，另一部分或多或少是疏水的并且面向所述颗粒的包含脂质的疏 水中屯、。脂质结合多肤优选具有如下特点：具有运样的两亲性a螺旋，其具有更多的主要 位于螺旋的一面上的疏水残基（如A、C、F、G、I、LM、V、W或Y)、W及更多的位于螺旋的另 一面上的极性或带电荷的残基（如D、E、N、Q、S、T、H、K或时。
[0029] 本文所述氨基酸残基的缩写如下：A，Ala,丙氨酸；V，Val,鄉氨酸山Leu,亮氨 酸；I，lie,异亮氨酸；P，Pro,脯氨酸；F，化e，苯丙氨酸；W，化p，色氨酸；M，Met,甲硫氨酸；G，Gly,甘氨酸；S，Ser,丝氨酸；T，1'虹，苏氨酸；C，切S，半脫氨酸；Y，Tyr,酪氨酸；N，Asn, 天冬酷胺；Q，Gln,谷氨酷胺；D，Asp,天冬氨酸化Glu,谷氨酸；K，Lys,赖氨酸；R，Arg,精 氨酸；和H,化S,组氨酸。
[0030] 与现有技术中的载脂蛋白衍生纳米盘不同，本发明所述脂质结合多肤不W双带样 形式包封脂质（参见图1)，相反，本发明所述颗粒通过包含脂质的核屯、保持在一起，所述 脂质被两个或更多个近似V形或飞旋标形状的W头-尾方向排列的脂质结合多肤围绕，并 且在本发明所述颗粒中，每个所述脂质结合多肤之间实质上没有直接的蛋白与蛋白的接触 (参见图2-7)。希望不限于理论，认为本发明的颗粒中的脂质结合多肤和脂质的运种排列 方式提供了尺寸可变性，运在体积大的疏水试剂或量增加的脂质被纳入本发明的颗粒中时 可W观察到。
[0031] 尽管SAPLIP具有与脂质相互作用的能力W及上述的两亲性性质，并且S维结构 高度保守，但是它们在氨基酸序列水平上是高度多变的，其序列同一性低于定义同源性通 常所用的 25-30% 同一性的阔值范围（参见"化Uhn(2005),BiochemJ389(15):249 - 257" 的图4A和4B中的序列比对，本文W引用方式特别将其附图并入本文）。
[0032] 在本发明所述脂蛋白颗粒中，脂质结合多肤主要作为结构蛋白，为本发明所述脂 蛋白颗粒提供盘状结构框架。由于运个原因，与仅仅为序列决定相比，结构特征、特别是 SAPLIP的銷脂激活蛋白折叠运一特征对于限定本发明的脂质结合多肤更加重要。
[0033] 本发明所述SPLIP的例子为銷脂激活蛋白A、B、C或D(例如W下来源的：人Olomo sapiens)[参见沈QIDNO. 1-4]、马巧quusC油alius)、牛度OStaurus)、小家鼠（Mus mus州Ius)、家兔（Oryctolagus州ni州Ius)、大家鼠（Rattusnorvegicus)或非洲爪赡 狂enopusIaevis));表面活性蛋白B(例如W下来源的：人、家犬（Canisfamiliaris)、 小家鼠、家兔、绵羊（Ovisaries)或大家鼠）；粒溶素（例如人源的，参见SEQIDNO. 5); NK细胞溶素（如野猪（Susscrofa)源的；参见SEQIDNO. 6) ;NK细胞溶素直系同源 物（Odhologues)(如马或牛来源的）；阿米己穿孔素（如溶组织内阿米己巧ntamoeba histolytica)来源的）；阿米己穿孔素直系同源物（如迪斯帕内阿米己巧ntamoeba dispar)或侵袭内阿米己巧ntamoebainvadens)来源的）；阿米己穿孔素样蛋白（如肝 片吸虫（Fasciolahepatica)来源的）；耐格里属阿米己穿孔素（化egleriapores)(如福 氏耐格里阿米己（化egleriafowleri)来源的）；Clo;rno;rin(如华支睾吸虫（Clonorchis sinensis)来源的）；銷脂激活蛋白原（如人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪赡来源 的）和MSAP(如人源的）。
[0034] 本发明所用的特定的SAPLIP的序列在文献"化Uhn(2005)，BiochemJ389(15): 249-257"的图4A和4B中给出，其中所述附图和序列特意通过引用方式并入本文。本发明 所用的特定SAPLIP的序列在如下序列中给出：SEQIDNO. 1銷脂激活蛋白A[人];SEQID N