木犀草素的新用图

文档序号:9441825阅读:697来源:国知局
木犀草素的新用图
【技术领域】
[0001] 本申请涉及木犀草素的新用途,具体地,涉及木犀草素用于制备用于预防和治疗 手足口病的药物的用途,尤其是用于制备抗肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型药物的 用途。
【背景技术】
[0002] 手足口病是一种常见的儿童传染病,主要病原是肠道病毒71型(Enterovirus71, 简称为EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16,简称为CA16)。近年来,手足口 病在亚太地区的频繁爆发已经成为了严重的社会健康问题。据统计,我国从2008年至2012 年,超过七百万例的手足口病被报道,并导致了 2443例死亡。
[0003] 目前仍没有上市的疫苗来预防手足口病。在治疗方面,目前临床常使用阿昔洛韦、 更昔洛韦、利巴韦林等常规抗病毒药物,并结合板蓝根、注射用双黄连、清开灵冲剂等。虽然 以上药物已经用于治疗手足口病,但是它们都属于广谱的清热解毒药物,直接作用机制不 明且针对性不强。仍缺乏专门针对EV71/CA16的药物。
[0004] 虽然现在已经发现,黄酮类化合物猫眼草黄素(chrysosplenetin)和黄酮类垂叶 黄素(penduletin)均表现出抗EV71/CA16活性(对于人横纹肌肉瘤细胞,猫眼草黄素的 IC 5。(半数抑制浓度)为0. 20 ii M,黄酮类垂叶黄素的IC5。为0. 37 ii M),但是两者的细胞毒 性较大:对于人横纹肌肉瘤细胞,猫眼草黄素的CC5。(细胞存活率为50%时的药物浓度)为 13. 9 iiM,黄酮类垂叶黄素的CC5。为74. 18 ii M(Zhuet al.,2011)。仍然需要开发针对EV71/ CA16的低细胞毒性药物。
[0005] 木犀草素,化学名:3',4',5, ' 7-四轻黄酮,化学式为C15H10O6,分子量为286. 23, 其结构式如下:
[0006]
[0007] 木犀草素多以糖苷的形式存在于多种植物中,这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊 花、金银花、紫苏含量较高,具有镇咳和祛痰作用。研究表明,木犀草素抑制巨噬细胞磷酸 化,抑制转录因子NF-K B的活性,能够抑制脂多糖诱导的巨噬细胞产生细胞因子IL-6、 TNF-a。木犀草素还能提高IFN-Y,降低特异性的Ig-E,减少嗜酸性粒细胞的浸润。另外, 木犀草素除了抗炎、抗过敏作用以外,还具有抗SARS、抗HIV病毒的特性。但是尚未报道过 木犀草素对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的抗病毒作用。

【发明内容】

[0008] 发明人从400种天然产物单体中筛选获得了一个黄酮类化合物--木犀草素,并 惊讶地发现木犀草素能够在细胞水平上有效抑制肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的复 制,其对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型造成的细胞病变效应和空斑效应有抑制作用且 对细胞的毒性较低,因此木犀草素可以成为抗手足口病病毒的候选药物,可以用于预防或 治疗手足口病,尤其用于对抗肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型病毒。
[0009] 本发明提供了木犀草素在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中的 用途。优选地,所述受试者是人。更优选地,所述受试者为16岁以下的儿童。最优选地,所 述受试者为5岁以下的儿童。
[0010] 优选地,所述预防或治疗手足口病的药物是抗肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒 A16型的药物。
[0011] 优选地,所述药物包含活性成分木犀草素和一种或多种可药用载体。
[0012] 优选地,所述药物还可包含其他用于治疗手足口病的活性成分。
[0013] 本发明还提供了一种用木犀草素抑制由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型 引起的细胞病变效应的方法,所述方法包括使浓度为〇. 1-400 U M的木犀草素与细胞接触。
[0014] 优选地,木犀草素的浓度为0. 39-200 i! M,更优选地,木犀草素的浓度为 6. 25-150 ii M,最优选地,木犀草素的浓度为12. 5-100 ii M。
[0015] 优选地,所述细胞是人细胞,更优选地,所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。
[0016] 本发明还提供了一种用木犀草素抑制由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型 引起的空斑形成的方法,所述方法包括使浓度为5-400 ii M的木犀草素与细胞接触。
[0017] 优选地,木犀草素的浓度为6. 25-100 ii M,更优选地,木犀草素的浓度为 12.5-50u M0
[0018] 优选地,所述细胞是人细胞,更优选地,所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。
[0019] 在本发明中由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型引起的细胞病变效应是指 由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型病毒在宿主细胞内大量增殖,导致细胞病变甚至 死亡的效应。
[0020] 在本发明中由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型引起的空斑形成是指肠道 病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型感染已形成致密单层状态的细胞群体时,经过一定培养 时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染、死亡、脱落,形成肉眼可见的空斑。所述细胞是 人细胞,更优选地,所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染肠道病毒71型和/或柯萨奇 病毒A16型的受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。
【具体实施方式】
[0021] 除非另外说明,实施例中使用的各种仪器和试剂均为普通市售品。在文本中,ATCC 是美国典型培养物保藏中心的简称。
[0022] 实施例1 :木犀草素对细胞的细胞毒性以及对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型 造成的细胞病变效应的抑制作用
[0023] 取对数生长期的人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞,购自ATCC,登录号:#CCL_136)和 稳定表达EV71/CA16受体hSCARB2基因(NCBI登录号:NM_005506. 3)的RD细胞(简称 RDS细胞,获自吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室,构建方法参见Lietal.Virology Journal, 10:250)分别以3XIO4个/孔和6XIO4个/孔的浓度接入96孔培养板,培养24 小时。RD细胞和RDS细胞均在37°C和5%CO2下培养,其中培养RD细胞使用的培养基为补 充有10%胎牛血清的DMEM培养基(简称为10%FBS-DMEM,FBS和DMEM均购自Sigma),培 养RDS细胞使用的培养基为含有0. 5iig/ml嘌呤霉素(购自Clontech)的10%FBS-DMEM。
[0024] 各孔加入50ii L含不同浓度木犀草素(购自中国药品生物制品检定所)的补充 有2%胎牛血清的DMEM培养基(简称为2% FBS-DMEM,FBS和DMEM均购自Sigma),使孔中 的木犀草素终浓度为 200 U M, 100 U M, 50 U M, 25 U M, 12. 5 U M, 6. 25 U M, 3. 12 U M, L 56 U M, 0. 78 ii M,0. 39 ii M,每个浓度设3个复孔,继续培养细胞48小时,用荧光细胞活性检测试剂 盒(购自Promega公司)检测细胞活性。操作按照试剂盒说明书进行,在多标记微孔板检 测系统(Multilabel Plate Reader2030,购自 Perkin Elmer 公司)上测定 560nm 下的突光 值,荧光值的大小反映细胞的活性。
[0025] 在检测木犀草素对由EV71和CA16造成的细胞病变效应的抑制作用时,加药的同 时各孔加入50111^¥71伍¥71-0413)或0416化416-81 &)病毒(获自吉林大学艾滋病疫苗国 家工程实验室,参见Li et al. Virology Journal, 10:250)进行感染(两种病毒在RDS细胞 中的感染复数为〇. 005,在RD细胞
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