时空可调性抑制病理性靶细胞的系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤免疫学领域，更具体地，涉及到时空可调性抑制病理性靶细胞的 系统。
【背景技术】
[0002] 随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重 视。T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中起主要作用，近年来发展的利用基因改造技术表达肿瘤特 异性嵌合抗原受体（Chimericantigenreceptor,CAR)的免疫效应细胞显示出的革巴向性、杀 伤活性和持久性，为过继性细胞免疫治疗注入了新的解决方案。CAR是将识别肿瘤相关抗原 (TAA)的单链抗体（scFv)或抗体片段和T细胞或NK细胞的活化序列在体外进行基因重组， 形成重组质粒，在体外通过转染技术，转染经纯化与大规模扩增后的T细胞或NK细胞，称之 为CART细胞或CARNK细胞。CAR主要包含TAA特异性抗体的抗原结合部（细胞外域）以 及T细胞协同刺激结构（CD137和CD28)和信号传导结构（CD3〖细胞内域）。
[0003] 研究所展示的CART细胞在体内的扩增、持续活性、转化为记忆细胞以及其抗肿瘤 效果都非常出众。但是，其毒性作用不可忽视。在一些肿瘤中，CART细胞识别自身正常组 织表达靶抗原或者激活本身的T细胞诱导自身免疫反应，持续活化的T细胞和记忆T细胞 可能会构成实质性危害，例如由于交叉反应所致器官靶向毒性等。
[0004] 因此，本领域迫切需要研究化解CART细胞的毒性作用、但能有效甚至高效杀伤肿 瘤细胞的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种时空可调性抑制病理性靶细胞的系统。
[0006] 在本发明的第一方面，提供用于抑制病理性靶细胞的系统，其中包括：
[0007] (1)融合蛋白，包括多肽标签和特异性识别病理性靶细胞的结合分子；和
[0008] (2)嵌合抗原受体（CAR)免疫效应细胞，其表达特异性识别所述多肽标签的结合 分子（包括识别所述多肽标签的抗体或配体等）。
[0009] 在一个优选例中，所述的多肽标签为具有低免疫原性（包括无免疫原性）的无关 抗原，其在非肿瘤组织中低表达或不表达。
[0010] 在另一优选例中，所述的多肽标签是内源或外源的多肽。
[0011] 在另一优选例中，所述的多肽标签选自但不限于：WTE，E-tag，Flag,Myc，His6等。
[0012] 在另一优选例中，所述的多肽标签是WTE标签。
[0013] 在另一优选例中，所述的多肽标签是SEQIDN0:38所示核苷酸序列编码的多肽。
[0014] 在另一优选例中，所述的多肽标签可以融合在所述特异性识别病理性靶细胞的结 合分子的N端或C端，也可以同时融合在抗体的N端和C端。
[0015] 在另一优选例中，所述的病理性靶细胞是肿瘤细胞，所述的特异性识别病理性靶 细胞的结合分子结合于肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原。
[0016] 在另一优选例中，所述的肿瘤相关抗原选自（但不限于）：
[0017] EGFR，EGFRvIII，de4EGFR，EpCAM，CD19,CD20,CD33,HER2,EphA2,IL13R，⑶2,LMP1， Claudinl8.A2,PLAC1，NY-ES0-1，MAGE4,MUC1，MUC16,LeY，CEA，GPC3,Mesothelin，CAIX(碳 酸酐酶IX)，CD123,IL13R，EphA2。
[0018] 在另一优选例中，所述的结合分子是配体或抗体，所述抗体包括（但不限于）： Fab、F(ab'）、F(ab'）2、Fv、dAb、FcU互补决定区（CDR)片段、单链抗体（scFv)、二价单链抗 体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体；单克隆抗体。
[0019] 在另一优选例中，所述的肿瘤包括（但不限于）：肝癌、肺癌、胶质瘤、乳腺癌、胃 癌、前列腺癌、脑肿瘤、卵巢癌、骨肿瘤、结肠癌、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、肠肿瘤、肾肿瘤、肾 上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤、食管癌、胸腺间 皮瘤、胰腺癌、白血病、头颈部肿瘤、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、阴道上皮癌、胆囊癌、恶性纤 维组织细胞瘤。
[0020] 在另一优选例中，所述的免疫效应细胞包括：T淋巴细胞（包括⑶4+或⑶8+T淋巴 细胞），NK细胞。
[0021] 在另一优选例中，所述的病理性靶细胞是表达（较佳地高表达）EGFRvIII的肿瘤 细胞；且
[0022] 所述的特异性识别病理性靶细胞的结合分子是特异性结合EGFRvIII的抗体（较 佳地为CHl2抗体）。
[0023] 在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞重组表达⑶28 (较佳地包括 CD28a，CD28b)，CD137,CD3 4 (较佳地为CD3 4 细胞内域），CD27,CD8,CD19,CD134,CD20， FcRy中的一种或多种。
[0024] 在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞中包含构建物，所述构建物 包含以下操作性连接的元件：特异性识别所述多肽标签的结合分子编码序列、CD8铰链区、 ⑶28a、⑶28b、⑶137、⑶3较佳地还包含eGFP、F2A)。更佳地，所述构建物中各元件按 照以下次序（5' 一 3'）连接：特异性识别所述多肽标签的结合分子编码序列、CD8铰链区、 CD28a、CD28b、CD137、CD3 4 (较佳地 5' 端还包含（5, 一 3'）eGFP、F2A)。
[0025] 在本发明的另一方面，提供前面任一所述的系统的用途，用于制备抑制病理性靶 细胞的药盒。较佳地，该用途为非治疗性的用途。
[0026] 在本发明的另一方面，提供一种用于制备所述的药盒的试剂盒，所述的试剂盒中 包括：
[0027] (a)表达构建物a，其包括融合蛋白的表达盒（能在免疫细胞中表达），所述融合蛋 白包括多肽标签和特异性识别病理性靶细胞的结合分子；
[0028](b)表达构建物b，其包括表达特异性识别所述多肽标签的结合分子（包括识别所 述多肽标签的抗体或配体等）的表达盒（能在免疫细胞中表达）；和
[0029](C)免疫效应细胞。
[0030] 在一个优选例中，所述的病理性靶细胞是肿瘤细胞，所述的特异性识别病理性靶 细胞的结合分子结合于肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原；和/或
[0031] 所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞重组表达⑶28 (较佳地包括⑶28a，⑶28b)， 0)137,0)3 4(较佳地为0)3 4细胞内域），0)27,0)8,0)19,0)134,0)20，卩〇1^中的一种 或多种。
[0032] 在另一优选例中，所述的表达构建物a或表达构建物b可以是一个载体或多个载 体。
[0033] 在本发明的另一方面，提供一种抑制病理性靶细胞的方法，所述方法包括：给予受 试者所述的抑制病理性靶细胞的系统。
[0034] 在本发明的另一方面，提供一种时空可调性抑制病理性靶细胞的方法，所述方法 包括：给予受试者嵌合抗原受体免疫效应细胞，其表达特异性识别多肽标签的结合分子； 当需要抑制病理性靶细胞时，给予受试者融合蛋白，所述融合蛋白包括多肽标签和特异性 识别病理性靶细胞的结合分子，从而介导免疫效应细胞发挥杀伤病理性靶细胞的作用。
[0035] 在本发明的另一方面，提供一种分离的多肽（WTE标签），所述的多肽的氨基酸序 列由SEQIDNO:38所示的核苷酸序列所编码。
[0036] 在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDN0:38所 示或其简并序列。
[0037] 在本发明的另一方面，提供一种特异性结合所述多肽（WTE标签）的单链抗体，所 述的单链抗体由SEQIDNO: 35所示的核苷酸序列所编码。
[0038] 在本发明的另一方面，提供一种编码所述单链抗体的多核苷酸，其核苷酸序列如 SEQIDNO:35所示或其简并序列。
[0039] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0040] 图1、pK/WTE-CH12L表达载体结构示意图。
[0041] 图2、pH/WTE-CH12H表达载体结构示意图。
[0042] 图3、抗体WTE-CHl2结构模式图。
[0043] 图4、本发明中包含编码CAR序列的慢病毒载体pWPT/eGFP-2D8 (anti-WTE) -CD28a -CD28b-CD137-CD3 4的结构示意图。
[0044] 图5、纯化的WTE-CH12抗体的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 检测，M为分子量标记，泳道1表示纯化的WTE-CH12抗体。
[0045] 图6A、通过荧光激活细胞分选仪（FACS)显示的WTE-CH12抗体与U87MG肿瘤细胞 的特异性结合的测定。
[0046] 图6B、通过荧光激活细胞分选仪（FACS)显示的WTE-CH12抗体与U87MG-EGFRvIII 肿瘤细胞的特异性结合的测定。
[0047] 图6C、通过荧光激活细胞分选仪（FACS)显示的WTE-CH12抗体与Huh-7肿瘤细胞 的特异性结合的测定。
[0048] 图6D、通过荧光激活细胞分选仪（FACS)显示的WTE-CH12抗体与Huh-7-EGFRvIII 肿瘤细胞的特异性结合的测定。
[0049] 图7A、通过荧光激活细胞分选仪（FACS)显示的慢病毒载体感染后CAR+T细胞的比 例。
[0050] 图7B、通过荧光激活细胞分选仪（FACS)显示的慢病毒载体感染后CAR+⑶4+T细胞 的比例。
[0051] 图7C、通过荧光激活细胞分选仪（FACS)显示的CAR+CD8+T细胞的比例。
[0052] 图8A、系列梯度稀释的WTE-CH12抗体诱导的CAR+T细胞对U87MG、U87MG-EGFRvIII 肿瘤细胞的杀伤率比较。
[0053] 图8B、系列梯度稀释的WTE-CH12抗体诱导的CAR+T细胞对Huh-7、Huh-7-EGFRvIII 肿瘤细胞的杀伤率比较。
[0054] 图9、WTE多肽对WTE-CH12介导的表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞对肿瘤细胞毒 性效果的体外竞争抑制试验。
[0055] 图10、N0D/SCID荷瘤（U87MG-EGFRvIII)小鼠模型显示的WTE-CH12抗体诱导的 CAR+T细胞治疗组和对照组的抗肿瘤活性测定。
[0056] 图11、N0D/SCID荷瘤（Huh-7-EGFRvIII)小鼠模型显示的WTE-CH12抗体诱导的 CAR+T细胞治疗组和对照组的抗肿瘤活性测定。
【具体实施方式】
[0057] 本发明人经过广泛的研究，揭示了一种基于肿瘤特异性嵌合抗原受体（CAR)技术 的时空可调性抑制病理性靶细胞的方法。经本发明人改造的CAR免疫效应细胞（如CART 细胞）只有在介导物质存在的条件下才能够靶向病理性靶细胞，实现CAR免疫效应细胞的 持续扩增并发挥对肿瘤细胞的杀伤作用；而在介导物质不存在的条件下，CAR免疫效应细 胞不发挥作用（或发挥较弱的作用）。本发明为避免CAR免疫效应细胞在体内持续扩增和 对自身正常组织的交叉反应产生毒性作用提供了解决方案。
[0058] 本发明将嵌合抗原受体（CAR)免疫效应细胞中识别病理性靶细胞相关抗原（如肿 瘤相关抗原）的结合分子替换为识别多肽标签（无关抗原）的结合分子（如单链抗体），同 时将识别病理性靶细胞相关抗原的结合分子和多肽标签进行融合获得融合蛋白。采用这种 将识别病理性靶细胞相关抗原的结合分子游离于传统的CAR免疫效应细胞之外的模式可 以实现对该识别信号的选择性调控，在病理性靶细胞被清除后，融合蛋白的停用使患者体 内的CAR免疫效应细胞不具有靶向性，对此信号的阻断使CART细胞不能够识别自身正常组 织低表达的靶抗原和其持续的扩增，解决了这一问题可能引发的毒性作用。
[0059] 术语"嵌合抗原受体（CAR)免疫效应细胞"是本领域公知的，其是利用基因改造技 术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体的免疫效应细胞，在体外和临床试验中显示出一定的靶向 性、杀伤活性和持久性，为过继性细胞免疫治疗方法。所述的免疫效应细胞例如包括T细 胞，NK细胞。
[0060] 常规的制备"嵌合抗原受体免疫效应细胞"的方法