血栓靶向释放rgdf的抗栓剂聚天冬酰-rgdf的合成和应用
【专利说明】血栓靶向释放RGDF的抗栓剂聚天冬酿-RGDF的合成和应用 发明领域
[0001] 本发明涉及血栓靶向释放RGDF的聚天冬酰-RGDF，涉及它的制备方法，涉及它在 大鼠血栓模型上的靶向抗血栓作用。因而本发明阐明了聚天冬酰-RGDF作为靶向抗血栓剂 的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 血小板血栓是血栓形成的起始阶段，可以分为血小板粘附、活化和聚集三个过程。 在血小板血栓形成过程中，血小板膜上GPIIb/IIIa活化，构象发生改变，然后在Ca2+的参与 下，与纤维蛋白原或vWF上的R⑶四肽序列特异性结合将血小板和红血球偶联起来，形成血 栓。在血小板聚集过程中，纤维蛋白原或vWF上的RGDF与活化的血小板表面受体GPIIb/ IIIa结合起至关重要的作用。RGDF与被GPIlb/IIIa识别并竞争性抑制纤维蛋白原或vWF 与血小板结合，抑制血小板聚集。血栓形成部位富集了活化的血小板，这些血小板是血栓形 成的重要构件。如果能把RGDF定向释放到血栓形成部位，就可以使这些活化的血小板不能 参与血栓形成，从而有效地抑制血栓形成。可是，这个目标在本发明申请之前没有达到。根 据这些认识，发明人提出了本发明。本发明的突出创造性在于用聚天冬酰-RGDF将RGDF输 送到血栓形成部位，然后在血栓中有效地释放RGDF，发挥靶向抗血栓作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个内容是采用常规的液相合成，逐步接肽制备HClMrg(Tos)-Gly-A sp(OBzl)-Phe-OBzl〇
[0004] 本发明的第二个内容是采用标准方法，制备平均分子量为20964,链长为173个天 冬氨酸残基的聚天冬氨酸。
[0005] 本发明的第三个内容是采用EDC法将HCl?Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl 偶联到聚天冬氨酸的羧基上然后脱去RGDF的侧链和羧端保护基，制备聚天冬酰-RGDF。
[0006] 本发明的第四个内容是测定聚天冬酰-RGDF的抗血小板聚集活性。
[0007] 本发明的第五个内容是测定聚天冬酰-RGDF的抗血栓活性。
[0008] 本发明的第六个内容是测定聚天冬酰-RGDF对GPIIb/IIIa的影响。
[0009] 本发明的第七个内容是测定聚天冬酰-RGDF在血栓中释放RGDF。
[0010] 本发明中所出现的缩略语的说明：
[0011] RGDFArg-Gly-Asp-Phe
[0012] PD 聚天冬氨酸
[0013] 聚天冬酰-RGDF 聚天冬酰-Arg-Gly-Asp-Phe
[0014] THF 四氢呋喃
[0015] DCC 二环己基酰亚胺
[0016] DCU 二环己基脲
[0017] OBzl 苄氧基
[0018]Boc 叔丁氧羰基
[0019]Tos 对甲苯横酸基
[0020]OMe 甲氧基
[0021]HOBtN-羟基苯并三唑
[0022]NMMN-甲基吗啉
[0023]EDC 1_ (3_二甲氛基丙基）_3_乙基碳二亚胺
[0024]PAF 血小板活性因子
[0025] ADP 腺苷二磷酸
[0026] AA 花生四烯酸
[0027]TE 凝血酶
【附图说明】
[0028]图 1?聚天冬酰-RGDF的合成路线?i) 85%H3PO4,180°C，减压；ii)NaOH，H2O,(TC; iii)EDC/H0Bt;iv)DCC，HoBt，0°C;v)Na0H(2N)，H20,0°C;vi)氯化氢的乙酸乙酯溶液（4N); vii)CF3CO2H,CF3SO3H0
[0029] 图2.聚天冬酰-RGDF治疗的大鼠血液提取物和血栓提取物的FT-MS谱。
【具体实施方式】
[0030] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0031]实施例 1 制备HCl?Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
[0032] 1)制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl
[0033]将 4. 986g(ll. 64mmol)Boc-Arg(Tos)，I. 310g(9. 7mmol)H0Bt溶于 30mL无水THF， 往得到的溶液中加2. 398g(ll. 64mmol)DCC的无水THF溶液，冰浴搅拌20min，得到反应液 I。 将 3. 273g(9. 7mmol)Tos?Gly-OBzl与 30mL无水THF的溶液用NMM调pH9,得到反应液 II。 将反应液II加到反应液I中，室温反应12小时。TLC(丙酮：石油醚=2 : 1)显示反 应完成。过滤除去DCU沉淀，滤液减压浓缩，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，过滤除去DCU 沉淀。滤液分别用饱和NaHCO3 (50mLX1)，5 %NaHCO3 (50mLX2)，饱和NaCl(50mLX3)，5 % KHSO4 (50mLX3)，饱和NaCl(50mLX3)，5 %NaHCO3 (50mLX3)，饱和NaCl(50mLX3)洗，加无 水NaSO4干燥。滤出干燥后的乙酸乙酯溶液，减压浓缩得到的5. 339g淡黄色固体粗品用硅 胶柱纯化（丙酮：石油醚=1 : 4)，得到4. 93g(88% )纯品，为无色固体。
[0034] 2)制备Boc-Arg(Tos)-Gly
[0035]在冰浴下将 5. 291g(9. 19mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl溶于 20mL甲醇，往得到 的溶液中加14mLNaOH水溶液（2N)，搅拌1小时，TLC(丙酮：石油醚=I: 1)显示反应完 成。反应液用饱和KHSO4调？117,减压浓缩。残留液先用NaOH水溶液（2N)调pH9,再用乙醚 萃取。水层用饱和KHSO4调pH2,用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯萃取液加无水 NaSO4干燥。滤出干燥后的乙酸乙酯溶液，减压浓缩得到3. 782g(84% )B〇C-Arg(T〇s)-Gly， 为无色固体。ESI-MS(m/e) :377[M+H]+。
[0036] 3)制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
[0037]按照制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl的方法，从 2. 716g(8. 4mmol)Boc-Asp(OBzl)和 2. 993g(7mmol)Tos.Phe-OBzl，得到 2. 823g(79% )Boc-Asp(0Bzl)_Phe-0Bzl，为无色固体。
[0038] 4)制备HCl?Asp(OBzl) -Phe-OBzl
[0039]在冰浴下将I.Ig(I. 9mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于6mL乙酸乙酯中，往得 到的溶液中加入20mL氯化氢的乙酸乙酯溶液，搅拌4小时，TLC(丙酮：石油醚=1:5)显 示反应完成，减压抽去乙酸乙酯。残留物加20mL无水乙醚溶解，溶液减压浓缩。该操作反 复5次，以除去产品中的氯化氢。残留物最后加5mL无水乙醚研磨，得到0.787g(90% )产 品，为无色粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/e) :461[M+H]+。
[0040] 5)制备Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzI
[0041]按照制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl的方法，从1398mg(2. 9mmol) Boc-Arg(Tos)-Gly和1192mg (2. 4mmol) HCl .Asp (OBzl)-Phe-OBzl得到1355mg (61%) Boc-Arg (Tos) -Gly-Asp (OBzl) -Phe-OBzl〇ESI-MS (m/e) :928 [M+H]+.1H NMR(500MHz，CDCl3) d/ppm =7. 73 (d，2H)，7. 66 (s，1H)，7. 31 (m，9H)，7. 17 (m，7H)，7. 04 (m，2H)，6. 43 (s，2H)，5. 70 (s， 1H)，5. 03 (m，4H)，4. 82 (d，J = 7. OHz，1H)，4. 73 (m，1H)，3. 93 (m，1H)，3. 75 (d，J = 3. 76Hz， 1H)，3. 16 (s，1H)，3. 03 (m，2H)，2. 85 (m，1H)，2. 75 (m，1H)，2. 34 (d，3H)，I.99 (s，1H)，I.78 (s， lH)，1.57(m，3H)，1.40(m，10H)，1.25(m，lH).13CMMR(125MHz，CDCl3)d/ppm= 173.46， 171. 34,171. 22,171. 05,170. 19,169. 55,157. 08,157. 04,156. 00,142. 08,140. 70,135. 98， 135. 44,135. 16,129. 23,128. 54,128. 51,128. 37,128. 28,128. 16,126. 94,126. 00,80. 15, 67. 15,66. 83,60. 33,53. 95,52. 22,49. 41,43. 26,41. 10,40. 28,37. 43,35. 72,29. 66, 28. 36, 25. 30, 21. 35, 20. 97,14. 17。
[0042] 6)制备HCl?Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzI
[0043]按照制备HCl?Asp(OBzl)-Val-OBzl的方法，从 3. 36g(3. 62mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得 2. 85g(91%)HCl.Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl固体， 直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)817[M+H]+。
[0044] 实施例2制备聚天冬氨酸
[0045] 1)制备聚丁二酰亚胺
[0046]将 20.OgD，L-Asp和 10. 4gH3PO4 (85% )混匀并在 180°C减压（0?IMPa)反应 3. 5 小 时。反应物趁热产物用80mLDMF溶解，得到的溶液滴入400mL水中。生成的沉淀用砂芯漏斗 抽滤，滤饼磨碎成粉末，用水洗至中性，35°C减压干燥至恒重，得到14. 4g(98. 8% )聚丁二 酰亚胺，为淡灰色粉末。1HNMR(500MHz，CDCl3)d/ppm:5. 294 ( 丁二酰亚胺的H-3)，3. 233 ( 丁 二酰亚胺的H-4) ?13CNMR(125MHz，CDCl3)d/ppm: 173. 96 ( 丁二酰亚胺的C-3)，172. 69 ( 丁二 酰亚胺的C-1)，47. 82 ( 丁二酰亚胺的C-4)，33. 10 ( 丁二酰亚胺的C-5).IRS/cm1 :1711 和 1801 ( 丁二酰亚胺的C= 0)，1160 和 1213 ( 丁二酰亚胺的C-N)。
[0047] 2)制备聚天冬氨酸
[0048] 冰浴下将3g聚丁二酰亚胺和I. 4gNaOH用20mL水溶解，搅拌1小时，用浓度为 35%的盐酸调pHl，得到的溶液倒入300mL甲醇中。滤出生成的沉淀在40°C真空干燥，得 3. 2g聚天冬氨酸，为淡黄色固体。采用凝胶渗透色谱-多角激光光散射法测得聚天冬氨 酸的数均分子量（Mn)为20964g/mol，重均分子量（Mw)为30476g/mol，分子量分布（d)为 1.4537,数均聚合度为 173。[a]D25=L21(C= 0.01，H2O)。13CNMR(125MHz，CDCl3)d/ppm =177. 87,173. 41，172. 75,172. 05,171. 89,51. 76,51. 60,39. 12,37. 61。
[0049]实施例3制备聚天冬酰-Arg(Tos)-Gly-Asp-(OBzl)-Phe-OBzl
[0050] 先将83mg(0.0 (Mmmol)聚天冬氨酸溶于ImL无水DMF，冰浴下加入97mg(0. 72mmol) HOBt和360mg (I. 87mmol)EDC，0. 5小时后加入588mg(0. 72mmol) HCl ? Arg (Tos)-Gly-Asp ( 0Bzl)-Phe-0Bzl，NMM调pH9。室温搅拌24小时，TLC(二氯甲烷：甲醇，5