调控炎症因子或趋化因子产生的新药物靶点的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因技术领域，更具体地，本发明涉及调控炎症因子或趋化因子产生 的新药物靶点。
【背景技术】
[0002] 早在上个世纪40年代，表观遗传学这一概念就已经被胚胎学家C.H.Waddington 提出，近些年来随着DNA甲基化和组蛋白修饰被发现能稳定遗传下去之后，表观遗传学的 研究重点开始转向了对染色质状态的研究，特别是DNA甲基化和组蛋白修饰的研究[1]。越 来越多的研究发现，表观修饰的改变在很多生理和病理过程中发挥着很重要的作用[2]。
[0003]Toll样受体（TLR)是一类模式识别受体，在先天免疫反应过程中起着重要的作 用，是机体抗击病毒和微生物的第一道防线，同时在很多感染性疾病，自身免疫疾病，肿瘤 等疾病中Toll样受体家族也同样参与其中，介导干扰素以及炎症因子的产生。尽管Toll 样受体下游的信号转导机制现在已经基本研究清楚，但是信号通路的调控机制以及转录因 子入核之后的调控机制目前还有待于进一步的深入研究[3]。近期的一些研究发现，Toll 样受体被激活之后，染色质结构在很短时间内发生了迅速的改变，很多组蛋白修饰如乙酰 化和甲基化都发生了变化[4-6]，这意味着表观遗传改变在调控Toll通路下游基因表达上 也可能起到了很大的作用。组蛋白的甲基化和去甲基化是近年来表观遗传研究比较热门的 研究领域，不同的组蛋白甲基化修饰对于基因表达的激活或抑制起着重要的作用[7]。
[0004] 因此，有必要深入研究Toll样受体通路下游的甲基化修饰酶类的功能，研究Toll 样受体下游表观修饰的改变对于基因转录的调控机制，以期感染性疾病、自身免疫疾病、肿 瘤和动脉粥样硬化等疾病的防治提供有效途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供调控炎症因子或趋化因子产生的新药物靶点。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种组蛋白甲基化酶Suv4-20h2或其调节剂的用途， 用于制备调节炎症反应的组合物。
[0007] 在一个优选例中，所述的调节炎症反应包括：调节机体免疫反应，例如包括预防或 治疗炎症相关疾病或自身免疫性疾病。
[0008] 在另一优选例中，所述的调节剂是上调剂，所述的组蛋白甲基化酶Suv4-20h2或 其上调剂用于促进炎症反应（从而可防治：病原微生物感染疾病或肿瘤）。
[0009] 在另一优选例中，所述的调节剂是下调剂，所述的组蛋白甲基化酶Suv4-20h2的 下调剂用于抑制炎症反应（从而可防治：自身免疫疾病（如系统性红斑狼疮，类风湿性关节 炎），动脉粥样硬化，败血症）。
[0010] 在另一优选例中，所述的调节炎症反应包括调节炎症反应中炎症因子或趋化因子 的表达；
[0011] 所述的促进炎症反应包括促进炎症反应中炎症因子或趋化因子的表达；
[0012] 所述的抑制炎症反应包括抑制炎症反应中炎症因子或趋化因子的表达。
[0013] 在另一优选例中，所述的炎症因子或趋化因子包括：IL6,TNFa，IL1-P，ccl2， ccl5〇
[0014] 在另一优选例中，所述的上调剂是过表达所述的组蛋白甲基化酶Suv4-20h2的表 达载体。
[0015] 在另一优选例中，所述的组蛋白甲基化酶Suv4-20h2抑制剂包括：化学合成的组 蛋白甲基化酶Suv4-20h2抑制剂；以表达质粒为载体的抑制组蛋白甲基化酶Suv4-20h2的 病毒和非病毒产品；与组蛋白甲基化酶Suv4-20h2互补的核酸序列或序列片段。
[0016] 在另一优选例中，所述的组蛋白甲基化酶Suv4-20h2抑制剂是siRNA，选自核苷酸 序列如SEQIDN0:5~SEQIDN0:8任一所示的siRNA;较佳地，选自SEQIDN0:5或SEQID N0:8 所示的siRNA。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种用于抑制炎症反应的siRNA，所述的siRNA选自核 苷酸序列如3￡〇10勵:5~3￡〇10勵:8任一所示的8丨1?熟；较佳地，选自3￡〇10勵:5或5￡〇 IDN0:8 所示的siRNA。
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种筛选调节炎症反应的潜在物质的方法，所述方法 包括：
[0019] (1)用候选物质处理表达组蛋白甲基化酶Suv4_20h2的体系；和
[0020] (2)检测所述体系中组蛋白甲基化酶Suv4-20h2或其mRNA的表达；
[0021] 其中，若所述候选物质可降低（优选显著降低，如低20%以上，较佳的低50%以 上；更佳的低80%以上）组蛋白甲基化酶Suv4-20h2或其mRNA的表达，则表明该候选物质 是抑制炎症反应（从而可防治：自身免疫疾病（如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎），动 脉粥样硬化，败血症）有用的潜在物质；
[0022] 若所述候选物质可提高（优选显著提高，如高20%以上，较佳的高50%以上；更佳 的高80%以上）组蛋白甲基化酶Suv4-20h2或其mRNA的表达，则表明该候选物质是促进炎 症反应（从而可防治：病原微生物感染疾病或肿瘤）有用的潜在物质。
[0023] 在一个优选例中，步骤（1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达组蛋白甲基 化酶Suv4-20h2的体系中；和/或
[0024] 步骤（2)包括：检测测试组的体系中组蛋白甲基化酶Suv4-20h2的表达，并与对照 组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达组蛋白甲基化酶Suv4-20h2的体 系；
[0025] 其中，若所述候选物质可降低组蛋白甲基化酶Suv4-20h2或其mRNA的表达，则表 明该候选物质是抑制炎症反应（从而可防治：自身免疫疾病（如系统性红斑狼疮，类风湿性 关节炎），动脉粥样硬化，败血症）有用的潜在物质；
[0026] 若所述候选物质可提高组蛋白甲基化酶Suv4_20h2或其mRNA的表达，贝U表明该候 选物质是促进炎症反应（从而可防治：病原微生物感染疾病或肿瘤）有用的潜在物质。
[0027] 在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系（如过表达Suv4_20h2的Raw264. 7 细胞，或过表达Suv4-20h2的Hela细胞）（或细胞培养物体系）、亚细胞体系、溶液体系、组 织体系、器官体系。
[0028] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验 和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于调节炎症反应有用的物质。
[0029] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0030] 图1、Suv4-20h2在人鼠单核巨噬细胞TLR通路活化过程中显著下调。
[0031]a-b.Raw264. 7 细胞中suv4-20hl和Suv4-20h2 在 100ng/mLLPS刺激后mRNA和 Suv4-20h2蛋白水平的表达情况；
[0032]c-d.Raw264. 7 细胞中suv4-20hl和Suv4-20h2 在 100ng/mLLPS刺激后mRNA和 Suv4-20h2蛋白水平的表达情况；
[0033] e.Thpl细胞suv4-20hl和Suv4-20h2 在 100ng/mLLPS刺激 4 小时后mRNA的表达 水平；
[0034]f.正常人的外周血单个核细胞Suv4-20h2在100ng/mLLPS刺激4小时后mRNA的 表达水平；
[0035]g.Raw264. 7 细胞中分别用TLR2/3/7/9 的配体pam3csk4 (0?f5ug/mL)，poly(I:C) (lOug/mL)，R837 (lug/mL)，0DNA(3uM)，0DNB(0? 5uM)刺激 4h之后Suv4-20h2 的表达水平； 以上数据代表三次实验重复；P〈〇. 01。
[0036] 图2、Suv4_20h2能促进炎症因子的产生。
[0037] a_c.raw264. 7细胞中转染 Suv4_2〇h2siRNA24 小时之后的 Knockdown效率（a)以 及 LPS刺激之后 IL6,TNFa，ILl-beta，ccl2和 ccl5的表达水平（b，c);
[0038]d-e.在Raw264. 7细胞中过表达小鼠Suv4_20h2的全长蛋白（d)并筛选出稳转的 细胞系，检测LPS刺激4小时之后IL6和TNFa的表达水平（e);
[0039]f-g.在人的单核细胞系Thpl中转染Suv4-20h2的siRNA，24小时之后的 Knockdown效率（f)以及LPS刺激之后IL6和ccl2的表达水平（g);
[0040]h.在人Hela细胞中过表达人SUV4-20h2的全长蛋白，检测TNFa刺激6小时之后 NF-kB报告基因的激活程度。
[0041] 以上数据代表三次实验重复；P〈0. 01。
【具体实施方式】
[0042] 本发明人经过深入的研究，首次揭示组蛋白甲基化酶Suv4-20h2与炎症反应的发 生或发展密切相关。从而Suv4-20h2可以作为药物靶点开发调节炎症反应的药物。
[0043]Suv4_20h2作为靶点的应用
[0044] 本发明人进行了深入的研究，筛选了小鼠巨噬细胞系raw264. 7在TLR4配体脂 多糖（LPS，为本领域公知的制备炎症模型（细胞或动物模型）的刺激剂）刺激后的含有 set-domain家族的组蛋白甲基化酶mRNA的表达水平，并进一步研究Suv4-20h2在炎症因子 产生过程中的作用。具体地，本发明人通过RealtimePCR筛选了小鼠巨噬细胞系raw264. 7 在LPS刺激后的set-domain家族的组蛋白甲基化酶mRNA的表达水平，发现Suv4-20h2在 LPS刺激4h后能够下调近20倍左右。并且在小鼠骨髓诱导的巨噬细胞和人的单核细胞系 Thpl以及正常人的外周血单个核细胞（PBMC)接受LPS刺激以及其他TLR配体刺激后都发 现了该基因表达水平有不同程度的下调。通过Westernblot检测了raw264. 7细胞系以及 小鼠骨髓诱导的巨噬细胞在LPS刺激之后Suv4-20h2的蛋白水平也是下调的。接下来，本 发明人用针对该基因的siRNA以及对照siRNA在raw264. 7细胞中进行了Knockdown实验， 发现Suv4-20h2Knockdown后细胞再接受LPS刺激产生的炎症因子如IL6,TNFa，ILl-beta， ccl2和ccl5等都有下调。因此，本发明人的研究表明，单核巨噬细胞在接受TLR配体刺激 的过程中，Suv4-20h2对炎症因子和趋化因子的产生起着十分重要的调控作用，从而其可 作为一个新的药物干预靶点，为疫苗设计以及治疗包括病毒和细菌感染、肿瘤、动脉粥样硬 化、自身免疫病等疾病提供新的途径。
[0045] Toll样受体家族作为模式识别受体在先天免疫和适应性免疫应答中扮演了重要 的角色。Toll样受体家族主要表达在单核/巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞等细胞上感应 来自于病原微生物的脂多糖（LPS)、RNA、DNA或鞭毛蛋白等病原体相关分子模式，诱导下游 炎症因子以及趋化因子和I型干扰素的产生[3]，而炎症因子以及趋化因子的产生能改变 血管的通透性，并吸引粒细胞等先天免疫细胞透过血管壁进入炎症反应部位消灭细菌[8]; 同时，TLR通路激活之后能活化抗原呈递细胞，诱发适应性免疫应答，从而达到彻底清除外 来病原微生物的目的[3]。
[0046] 除了抗击外源微生物的作用之外，经过十多年的研究，人们发现Toll样受体在介 导自身免疫疾病如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎以及肿瘤，动脉粥样硬化等疾病中也 发挥了作用[9]。在自身免疫疾病中，TLR通路过度活化导致炎症因子和I型干扰素分泌， 进而造成组织损伤，诱发自身免疫疾病。例如，在系统性红斑狼疮的病人中，能够产生抗自 身的核酸以及核小体等的抗核抗体，研究发现，存在于SLE病人免疫复合物中的DNA能够激 活TLR9通路[10]。在SLE病人中，炎症因子和趋化因子如TNF-a，IL-6等的表