人源化aFGF单链抗体在治疗肿瘤中的医用用图
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种人源化aFGF单链抗体在治疗肿瘤中的医用用途，公开了人源 化aFGF单链抗体抑制肿瘤细胞增殖的作用，具体涉及人源化aFGF单链抗体基因构建、蛋白 活性检测以及抗肿瘤应用，属于生物制药技术领域。
【背景技术】
[0002] 酸性成纤维细胞生长因子（acidfibroblastgrowthfactor,aFGF)是成纤维细 胞生长因子超家族成员之一，在多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤的发生和发展具有密切联 系。aFGF可以与细胞表面的受体结合，通过胞外和胞内两个途径发挥作用，前者可使受体磷 酸化，后者与其受体结合后发生跨膜转运，进入细胞浆及细胞核直接作用于DNA，促进肿瘤 细胞增殖。aFGF还可通过促进肿瘤细胞血管发生为肿瘤的发生和转移提供条件。研究表明 aFGF基因的mRNA在膀胱癌移行细胞癌、卵巢癌及卵巢交界性肿瘤组织中均呈过度表达，当 发生癌变时卵巢癌组织细胞中aFGF基因活性增强，导致合成过量的aFGF，而aFGF又进一步 引起卵巢癌组织内血管内皮细胞及毛细血管的形成，从而加速了癌细胞随血液的转移。此 外，对乳腺的研究结果表明正常表达水平的aFGF可以促进乳腺发育和维持正常功能，异常 的aFGF的高表达与乳腺癌恶性程度成正相关。
[0003] 关于aFGF表达的生物学意义已引起学者们关注，人们期望利用aFGF的拮抗剂抑 制aFGF与其受体的结合作为抑制肿瘤细胞增殖的手段，针对aFGF的单克隆抗体能有效抑 制aFGF的生物学作用。目前，单链抗体（singlechainvariablefragment，scFv)介导的 肿瘤治疗已经逐渐成为一条有效途径，单链抗体具有易于构建表达、分子量小、穿透力强、 特异性好、免疫原性低等优点。此外，单链抗体还可以与毒素、前体药物转化酶、放射性同位 素、细胞因子等效应分子构建成多种双功能抗体分子，单链抗体也是构建双特异抗体的理 想元件。以上特点使单链抗体在肿瘤的临床诊断、预防和治疗方面，显示出了巨大的潜力。 应用单链抗体与肿瘤表面或细胞内的相应抗原结合，可导致肿瘤细胞信号传导系统改变， 从而起到抑制肿瘤的作用。
[0004]目前市场上采用的单克隆抗体多是鼠源性的，当用于人体时可引起人抗鼠免疫反 应，加速了鼠源抗体药物在体内被清除的速率，同时还会伴随强烈的致敏反应，在人体中产 生一定的副作用。研制人源化抗体可以降低抗体药物在人体的免疫原性；与鼠源性抗体相 比，人源化抗体还可提高效应功能，加强对肿瘤靶细胞的杀伤作用。鼠源抗体人源化改造最 常用也是最有效的方法是在嵌合抗体的基础上进一步将鼠单抗可变区中相对保守的鼠源 的FR区替换成人源的FR区，只保留与抗原结合的鼠源的CDR区，从而获得人源成分更多的 CDR移植抗体或改型抗体，很多以这项技术为基础的抗体药物都已进入临床II、111期试验。
【发明内容】
[0005] 本发明公开了人源化aFGF单链抗体（aFGF-hscFv)在治疗肿瘤中的医用用途，具 有明显的医疗效果。
[0006]本发明利用生物工程技术制备并纯化aFGF-hscFv，进行抗肿瘤治疗研究，为以 aFGF为靶点的抗肿瘤治疗提供新途径。
[0007] 本发明所述的aFGFhscFv的基因序列，其特征在于：如SEQNo. 1所示。
[0008] 本发明涉及的aFGFhscFv是以小鼠源aFGF单链抗体基因为模板，结合小鼠源 aFGF单链抗体的CDR序列、人源FR模板及FR模板中需要回变的氨基酸残基，获得人缘化 单链抗体的氨基酸序列及密码子优化的核苷酸序列。aFGFhscFv由一条连接肽将轻链（\) 和重链（VH)连接在一起所形成的两个可变区首尾相接的单一肽链，通过正确折叠，两个可 变区由非共价键形成具有抗原结合功能的片段，分子量仅为完整IgG的1/6,易穿入固体组 织及肿瘤内部，具有亲本抗体结合抗原的特性和功能以及较低的人抗鼠反应，能够有效抑 制MDA-MB-231乳腺癌细胞和NIH-3T3成纤维细胞增殖。aFGFhscFv是具有抗乳腺癌医用 价值的免疫治疗制剂。
[0009] 通过以下试验表明本发明aFGF-hscFv在抗肿瘤的医用用途： 1、培养MDA-MB-231和NIH-3T3细胞，分别添加不同浓度的aFGF-hscFv处理24,48， 72小时。利用CCK-8试剂盒检测aFGF-hscFv对细胞增殖的影响。实验结果显示，随着 aFGF-hscFv浓度增加，细胞存活率逐渐降低，且aFGF-hscFv作用时间越长，细胞存活率越 低，表明aFGF-hscFv能够中和肿瘤细胞内源性aFGF，实现对肿瘤细胞增殖的抑制作用。 aFGF-hscFv对肿瘤细胞的半抑制浓度（IC50)为1. 358nmol/ml。
[0010] 2、培养MDA-MB-231 和NIH-3T3 细胞，分别添加 1. 358nmol/mlaFGF-hscFv处理 24,小时。流式细胞术检测aFGF-hscFv对肿瘤细胞周期的影响。实验结果显示，aFGF-hscFv 能够引起肿瘤细胞周期G1期阻滞，从而达到对肿瘤细胞增殖的抑制作用。
[0011] 本发明的积极效果在于：利用生物工程技术制备并纯化aFGF-hscFv，进行抗肿瘤 治疗研究，为以aFGF为靶点的抗肿瘤治疗提供新途径；提供了aFGF-hscFv在抗肿瘤的新的 医用用途，具有明显的医疗效果，可广泛应用于抗肿瘤药物的制备。
【附图说明】
[0012] 图1为酶联免疫吸附实验检测aFGF-hscFv与aFGF的结合活性； 表1为MTT法检测aFGF-hscFv处理后细胞吸光值； 图2为流式细胞术检测aFGF-hscFv引起MDA-MB-231细胞和NIH-3T3细胞G1期阻滞。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1 1、人源化aFGF单链抗体与aFGF的结合活性检测 (1)以包被缓冲液（50mMpH9. 6 碳酸盐缓冲液：Na2C03 1. 59g/L，NaHC03 2. 93g/L)稀 释aFGF蛋白抗原至终浓度为lOPg/ml，取100W的量加到96孔酶标板包被，4°C下过夜。
[0014] (2)第2天弃掉包被缓冲液，用洗涤缓冲液PBST充分洗涤3次。每孔加入100W 封闭液（5%BSA)，37 °C封闭1小时。
[0015] (3)用PBST溶液充分洗涤3次，加入倍比稀释的人源化aFGF单链抗体，37°C反应 1小时。
[0016] (4)用PBST充分洗涤3次，每孔加入100W小鼠源抗His标签一抗（1 :1000稀释)， 37 °C反应1小时。
[0017] (5)用PBST充分洗涤3次，每孔加入100WHRP-山羊抗小鼠二抗（1 :15000稀释)， 37 °C反应1小时。
[0018] (6)用PBST充分洗涤后，每孔加200WTMB显色液，室温避光反应30min。
[0019] (7)每孔加入50W2M硫酸终止反应，450nm测吸光值，检测人源化aFGF单链抗体 与aFGF的结合活性。以(实验组吸光值/阴性对照组吸光值)多1. 5为阳性结果，参见图1。
[0020]、人源化aFGF单链抗体抑制肿瘤细胞增殖作用检测 (1)收集对数生长的MDA-MB-231乳腺癌细胞和NIH-3T3成纤维细胞，调整细胞悬液浓 度至5X104个/ml，接种于96孔板中，每孔100y1。
[0021] (2)将10^-]\?-231和见11-313细胞分别置于无〇)2培养箱和5%〇) 2培养箱中，371€ 过夜培养，使细胞贴壁。
[0022] (3)分别加入0,15, 30,60,120, 240pmol纯化的aFGF单链抗体，每个浓度设置5 个重复孔，分别培养24,48和72小时。
[0023] (4)向96孔板每孔加入10y1CCK-8,继续培养4小时； (5)用酶标仪测定450nm处的吸光值，参见表1。
[0024] (6)根据各组吸光值计算细胞的生长抑制率，并计算药物IC50值。其中，生长抑制 率（％)=(1-实验孔平均0D值 / 对照孔平均0D值）X100% ;IC50=lg-l[Xm-i(5：P-0. 5)]。 注：Xm:设计的最大浓度的对数值；i:各浓度倍比浓度的对数值；2P:各组生长抑制率之 和；0. 5 :经验常数。
[0025]、人源化aFGF单链抗体引起肿瘤细胞周期阻滞检测 (1)收集对数生长的MDA-MB-231乳腺癌细胞和NIH-3T3成纤维细胞，调整细胞悬液浓 度至5X105个/ml，接种于6孔板中，每孔2ml。
[0026] (2)将6孔板置于合适的0)2培养箱中37°C过夜培养，使细胞贴壁。
[0027] (3)第二天，换无血清培养基，饥饿处理20小时使细胞同步化。
[0028] (4)分别添加纯化的aFGF-hscFv，以其IC50值为工作浓度，每个浓度设置5个重 复孔，继续培养24小时。
[0029] (5) 1000r/min离心5min，弃去培养液，收集细胞于50ml离心管。
[0030] (6)经PBS洗涤，1000r/min离心5min收集细胞。
[0031] (7)用300y1PBS重悬细胞，加入无水乙醇700y1使其终浓度为70%，冰上放置 15min固定。
[0032] (8) 1500r/min离心5min，除去固定剂。用PBS洗涤沉淀细胞，1500r/min离心 5min〇
[0033] (9)向沉淀细胞中加入900y1PBS重悬细胞，加100y1 500yg/mlPI溶液（含 200yg/mlRNA酶），室温孵育20min，避光。
[0034] (10)流式细胞仪检测细胞周期。参见图2。
[0035] 结论：所述的实验表明本发明的人源化aFGF单链抗体能够与aFGF蛋白结合，抑制 aFGF的生物学活性。在培养的肿瘤细胞中添加aFGF-hscFv，能够有效抑制肿瘤细胞增殖， 引起细胞周期G1期阻滞。aFGF-hscFv对肿瘤细胞的IC50值为1. 358nmol/ml。可以制成 抗肿瘤的药物。
[0036]表1.MTT法检测aFGF-hscFv处理后细胞吸光值：
【主权项】
1. 人源化aFGF单链抗体（aFGF-hscFv)在制备治疗肿瘤中的医用用途；所述的 aFGF-hscFv的基因序列如SEQNo. 1所示。2. 以人源化aFGF单链抗体（aFGF-hscFv)为主要活性成分制成的药物可以是药物学上 任何药物制剂。
【专利摘要】本发明提供了一种人源化aFGF单链抗体在治疗肿瘤中的医用用途，公开了人源化aFGF单链抗体抑制肿瘤细胞增殖的作用，具体涉及人源化aFGF单链抗体基因构建、蛋白活性检测以及抗肿瘤应用，本发明提供的是有实用价值的人源化单链抗体及其医用用途。利用生物工程技术制备并纯化aFGF-hscFv，进行抗肿瘤治疗研究，为以aFGF为靶点的抗肿瘤治疗提供新途径；提供了aFGF-hscFv在抗肿瘤中的新的医用用途，具有明显的医疗效果，可广泛应用于抗肿瘤药物的制备。
【IPC分类】A61P35/00, A61K39/395
【公开号】CN105214088
【申请号】CN201510746025
【发明人】朱筱娟, 俞华莉, 何潇潇, 杜爽, 王雅君, 施恒亮, 杨涛, 高世乾, 王伟
【申请人】东北师范大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月6日