通过抑制转录因子atf5来抑制肿瘤细胞的组合物和方法
【专利说明】通过抑制转录因子ATF5来抑制肿瘤细胞的组合物和方法
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年2月22日提交的序列号61/768, 390的美国临时申请的权益， 该临时申请的全部内以引用的方式并入本文。
[0003] 政府权益公告
[0004] 本发明得到批准号RCA126924A的美国国立卫生署资助项目的支持。因此，美国政 府对本发明享有某些权利。 1.【背景技术】
[0005] 美国每年有大约一百万人被诊断出癌症，而且目前有数百万各年龄段的美国人患 有某种类型的癌症。在这些人的一生当中，每两个美国男性中有一个以及每三个美国女 性中有一个将会被诊断出患有某种类型的癌症。在每年确诊患有癌症的一百万人中，有 1，7000人患有脑肿瘤。脑肿瘤侵袭并破坏正常组织，产生诸如感觉运动障碍和认知功能障 碍、颅内压增高、脑水肿以及压迫脑组织、脑神经和脑血管这样的症状。恶性脑肿瘤患者中 有25%的人的最初症状是困倦、无力、反应迟钝、人格改变、行为异常以及智力障碍。脑肿瘤 的治疗通常是多种方式的，这取决于肿瘤的病理学特点和位置。对恶性神经胶质瘤来说，包 括化学疗法、放射疗法和手术在内的多方式治疗用于设法减小肿瘤块。但不论采用何种方 法，脑肿瘤患者的预后能达到：化学疗法、放射疗法和手术后的平均生存时间仅为1年，这 些患者中只有25%的人生存时间为2年。
[0006] 癌症的患病率，尤其是现有治疗方法难以治愈的脑肿瘤的患病率使人们发现转录 因子对于神经细胞的细胞周期控制具有影响，转录因子包括ATF5(Acharay等，JStruct Biol155 :130-139(2006))。ATF5属于碱性亮氨酸拉链转录因子的转录激活因子/CREB 家族（等，JStructBiol155:130-139(2006);Greeneetal.，JNeurochem108: 11-22 (2009))。对于神经和神经胶质谱系，ATF5被神经干细胞和祖细胞高度表达，并且当这 些细胞发生分化时，其表达骤然下降（Angelastro等，JNeurosci23:4590-4600(2003); Angelastro等，JNeurosci25 :3889_3899(2005);Mason等，MolCellNeurosci29 : 372-380 (2005))。由于神经祖细胞中的组成型ATF5表达使这些细胞停留在细胞周期内 并阻挡它们分化，（Angelastro等，JNeurosci23:4590-4600(2003);Angelastro等，J Neurosci25:3889-3899(2005);Mason等，MolCellNeurosci29:372-380 (2005))，由于 GBM(多形性成胶质细胞瘤）被认为是源自于神经干细胞和祖细胞，因此对GBM中的ATF5表 达进行测定（Tanaka等，NatRevClinOncol10:14-26(2012))。对 29 例切除的GBM的 检查显示全部出现ATF5高表达，并且所有9个啮齿类和人类GBM谱系都出现ATF5高表达 (Angelastro等，Oncogene25:907-916(2006))。这些结论已经得到证实，并且有额外的 数据表明了ATF5水平与GBM预后之间的联系（Dong等，JNeuropatholExpNeurol64: 948-955(2005);Sheng等，NatMed16:671-677(2010))。
[0007] 为了检验ATF5在GBM中扮演何种角色，制造出一种显性阴性抑制剂蛋白来干扰 ATF5 功能（Acharay等，JStructBiol155 :130-139(2006)，Angelastro等，Oncogene25: 907-916 (2006))，并培养si/shRNAs以抑制ATF5的表达。人和大鼠GBM谱系的培养试验表 明d/n-ATF5和ATF5si/shRNAs都引起了它们的大量细胞凋亡（Angelastro等，Oncogene 25 :907-916(2006))。相比之下，ATF5+使神经祖细胞和星形胶质细胞增殖，未出现出这种 细胞凋亡反应。在最初的体内研究中发现，如果d/n-ATF5以逆转录病毒的方式递送，它将 会有选择性地并以极高的效率杀死由移植的C6大鼠GBM细胞产生的肿瘤细胞，但并不破坏 正常生长的脑细胞（Angelastro等，Oncogene25:907-916(2006))。在随后的研究中，使 用成年小鼠模型，在模型中，用表达TOGF-B的逆转录病毒和p53shRNA(Arias等，Oncogene 31 :739-751 (2012))进行感染以有效产生神经胶质瘤（等级范围从低分级神经胶质瘤至 GBM)。所使用的小鼠是经过改造以有条件地表达人GFAP启动子的d/n-ATF5 (其在神经干细 胞/祖细胞、星形胶质细胞和GBM中表达），d/n-ATF5的导入使肿瘤完全退化/根除，24只 治疗过的小鼠全部存活。同样地，在注射roGF-B/shRNA-p53逆转录病毒前，85%的小鼠体 内的d/n-ATF5的表达阻止了肿瘤生长。相比这下，对于未导入d/n-ATF5的小鼠，15/16患 上了肿瘤，并且有40%在试验期内死亡。正常细胞未受明显影响（Arias等，Oncogene31 : 739-751(2012))。 2.
【发明内容】
[0008] 在某些实施例中，本发明涉及用于治疗和/或预防肿瘤以及/或者促使赘生性细 胞凋亡的方法，该方法包括使赘生性细胞与细胞穿透显性阴性ATF5 ( "CP-d/n-ATF5"）接 触，其中CP-d/n-ATF5能够抑制ATF5的功能和/或活性。
[0009] 在某些实施例中，赘生性细胞选自由以下各项组成的集群：乳腺、子宫、子宫内膜、 胃、结肠、肝、胰腺、肾脏、膀胱、前列腺、睾丸、皮肤（例如，黑色素细胞/黑色素瘤细胞）、食 道、舌头、嘴、腮腺、喉、嗯、淋巴结、肺、血液（例如，血液系统癌症）、周围神经系统和脑部。 在某些实施例中，赘生性细胞选自由以下各项组成的集群：成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神 经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、间皮瘤和成神经细胞瘤。在某些实施例中，赘生性细胞 与原发性或复发性脑肿瘤相关。
[0010] 在某些实施例中，CP-d/n-ATF5为口服给药、肠胃外给药（例如，皮下给药）、鼻内 给药和/或经皮给药。
[0011] 在某些实施例中，CP-d/n-ATF5包含一部分人、大鼠或小鼠ATF5肽序列、或者 以上各项的组合。在某些实施例中，细胞穿透显性阴性ATF5包含选自由以下各项组 成的集群的序列:LEQENAE、LEKEAEELEQENAE、LARENEELLEKEAEELEQENAE、LEQRAEELAREN EELLEKEAEELEQENAE或LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAE,该序列与形成亮氨酸柃链的妝 连接，并且与细胞穿透序列连接。在某些实施例中，CP-d/n-ATF5包含选自由以下各项组 成的集群的序列：LEQENAELEGECQGLEARNRELKERAES、LEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELK ERAES、LARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELKERAES、LEQRAEELARNEELLEKEAEELEQE NAELEGECQGLEARNRELKERAES、LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELKERAESV, 其中，加下划线序列为显性阴性序列，其余序列为ATF5亮氨酸拉链，该序列可操作地与细 胞穿透序列连接（框内）。在某些实施例中，细胞穿透显性阴性ATF5包含选自由以下各项 组成的集群的序列：LEQENAELEGECQGLEARNRELRERAES、LEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELR ERAES、LARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRERAES.LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQE NAELEGECQGLEARNRELRERAES、LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRERAESV, 其中，加下划线序列为显性阴性序列，其余序列为ATF5亮氨酸拉链，该序列可操作地与细 胞穿透序列连接。
[0012] 在某些实施例中，细胞穿透显性阴性ATF5包含选自由以下各项组成的集群的序 列：(l)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRQIKIffFQNRRMKffKKDYKDDDDKMASMTGGQQMGRDPDLEQRAEELARE NEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRERAESV,其中，加下划线残基(MG-HM)为 6XHis_ 标 签前导序列，粗体残基（RQ-KK)为Penetratin序列，斜体残基（DY-DK)为Flag标签，字体 无改变的残基（MA-PD)为间隔氨基酸，粗斜体残基（LE-AE)为d/n序列，加下划线粗体残 基(LE-SV)为在第一缬氨酸后被截短的ATF5亮氨酸柃链：（2)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLEY GRKKRRQRRRYPYDVPDYAMASMTGGQQMGRDPDLEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRE LRERAESV,其中，加下划线残基(MG-LE)为6XHis_标签前导序列，粗体残基（YG-RR)为TAT 序列，斜体残基（YP-YA)为HA标签，字体无改变的残基（MA-PD)为间隔氨基酸，粗斜体残基 (LE-AE)为d/n序列，加下划线粗体残基(LE-SV)为在第一缬氨酸后被截短的ATF5亮氨酸 拉链；(3)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRQIKIffFQNR
[0013]RMKffKKLEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELKERAESV,其中，加下划 线残基(MG-HM)为6XHis-标签前导序列，粗体残基（RQ-KK)为Penetratin序列，斜体残基 (LE-AE)为d/n序列，加下划线粗体残基(LE-SV)为在第一缬氨酸后被截短的ATF5亮氨酸 拉链；以及(4)RQIKIffFQNRRMKffKKLEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELKERA ESV,其中，耜体残基(RQ-KK)为Penetratin序列，斜体残基（LE-AE)为d/n序列，加下划线 粗体残基(LE-SV)为在第一缬氨酸后被截短的ATF5亮氨酸拉链。在某些实施例中，细胞穿 透显性阴性ATF5为化学合成。
[0014] 在某些实施例中，本发明还涉及在治疗和/或预防肿瘤并且/或者促使赘生性细 胞凋亡中使用的试剂盒。以下描述将使本发明的其他方面清晰明了。 3.【附图说明】
[0015] 图1GFP-d/n-ATF5C-端截短的融合蛋白（GFP-d/n-ATF5-Tr)与C6神经胶质瘤细 胞中的全长GFP-d/n-ATF5蛋白达到相同的促使细胞凋亡水平。用pQC-X-I-eGFP、pQC-d/ n-GFPATF5或pQC-GFPATF5-tr转染C6细胞。2天后确定转染细胞中密集的凋亡细胞核的 百分比（平均值土SEM，n= 4 ;每种条件下细胞总记数约为200个）。T检验；GFP+细胞对 比GFP-d/n-ATF5+ 细胞或GFP-d/n-ATF5-tr细胞，（*p< 0? 05) ;GFP-d/n-ATF5+ 细胞对比 GFP-d/n-ATF5-tr细胞，（不显著）。
[0016] 图2细菌表达的纯化6x组氨酸-Flag标签Penetratin-Flag-D/ N-ATF5_tr(Pen-d/n_ATF5-RP)肽和 6x组氨酸-Flag标签Penetratin-Flag-对照（Pen-对 照-RP)肽的纯度和分子性质。（A)纯化Pen-d/n-ATF5-RP和Pen-对照-RP(每道5yg)的 SDS-PAGE被考玛斯染色。左侧显示分子量标记，每道上显示每种肽的线性图。在方法部分 中对纯化进行描述。（B)纯化Pen-d/n-ATF5-RP的LC-高分辩率质谱法的去卷积质谱。最 多的物种是无甲酰蛋氨酸的12, 948. 88Da单体形式，其次是甲酰蛋氨酸13, 127Da单体形式 (异构体）。质谱还显示出少量25,897.5〇3二聚体。（〇?611-(1/11-4了?5-1^在人血清中的 稳定性。Pen-d/n-ATF5-RP(36yM)与人血清（在PBS中25%v/v)在37°C培养0至48小 时。在不同时间取出等分试样，Pen-d/n-ATF5-RP肽通过SDS-PAGE分解，然后转移到PVDF膜，用抗-Flag抗体进行探测。使用LiCor软件通过近红外线检测抗-Flag信号，对预期量 的Pen-d/n-ATF5-RP条带进行密度测定，并用ImageJ确定数量。数值为平均值土SEM，n= 3〇
[0017] 图3培养的成胶质细胞瘤细胞对Pen-d/n-ATF5-RP的吸收和滞留。（A)与200nM Pen-对照-RP(左）或Pen-d/n-ATF5-RP(右）一起培养4小时的C6大鼠成胶质细胞瘤细 胞的共焦图像。细胞经过冲洗、固定以及用抗-Flag(红）和DAPI(蓝）染色。比例尺= 2ym。⑶大鼠C6和人U87成胶质细胞瘤细胞与3yMPen-d/n-ATF5-RP-起培养图中所示 时间，然后冲洗、固定以及用抗-Flag(绿）和DAPI(蓝）免疫染色。比例尺=5ym。
[0018] 图4Pen-d/n-ATF5-RP促使C6成胶质细胞瘤细胞凋亡。用3yMPen-d/n-ATF5-RP 或3yMPen-对照-RP处理C6细胞，或者不做处理。5天后确定细胞中密集凋亡细胞核的 百分比（平均值土SEM;在2个独立试验中n=4;细胞记数约为200个）。T检验；Pen-d/ n-ATF5-RP细胞对比Pen-对照-RP细胞或未经处理细胞，（*p<0. 05) ;Pen-对照-RP细胞 对比未经处理细胞，（P=0. 29)。
[0019] 图5Pen-d/n-ATF5-RP进入小鼠脑部并引起目标神经胶质瘤细胞凋亡。（A-F)用 Flag抗体对典型脑部切片染色以指示Pen-d/n-ATF5-RP或HA的存在，以此识别由逆转录 病毒（红）诱导的肿瘤的存在；用TUNEL识别细胞凋亡（绿），用DAPI定位细胞核（蓝）。 (A)用Pen-d/n-ATF5-RP治疗后24小时（最后一次注射后16小时）的鼠科动物脑部肿瘤 (逆转录病毒注射后52天）。（B)(A)中同一小鼠的对侧正常大脑半球。（C)注射生理盐水 后24小时的鼠科脑部肿瘤（注射逆转录病毒后59天）。通过增多的Flag抗体着色确认 经过治疗的小鼠（A，B)的细胞内出现Pen-d/n-ATF5,与生理盐水对照样本对比。与（B)和 (C)相比较，（A)中增多的TUNEL着色（绿）说明Pen-d/n-ATF5-RP引起神经胶质瘤细胞特 异性诱导凋亡。（D)逆转录病毒注射后160天和Pen-control-RP注射后3天的含有肿瘤的 脑部切片的TUNEL和DAPI着色。请注意识别肿瘤细胞的HA+细胞以及无TUNEL着色。（E) 与（D)同样着色，是含肿瘤切片的着色（逆转录病毒注射后143天）以及Pen-d/n-ATF5-RP 治疗后3天的着色。请注意，与（A)和（D)相比较，HA+肿瘤细胞中出现TUNEL着色，并且 着色呈现零碎的外观。（F)与（D)同样着色，是含肿瘤切片在逆转录病毒注射后150天的着 色以及Pen-d/n-ATF5-tr-RP皮下注射2次治疗后2天的着色。请注意着色图案与（E)中 零碎的TOGF-B-HA着色图案和TUNEL着色图案的定性相似度。比例尺等于20ym。
[0020] 图6给药后，Pen-d/n_ATF5-RP在小鼠体内不同时间的滞留情况。如本文所述，小 鼠接受4次生理盐水（A)或Pen-d/n-ATF5-RP(B，C)腹腔内注射。最后一次注射后40小时 (A，B)或64小时（C)后杀死动物，用抗-Flag(红色；以显现Pen-d/n-ATF5-RP)或DAPI(蓝 色；以显现细胞核）对动物的固定脑部切片染色。（D)抗-Flag免疫染色的密度测定。确 定每个图像中十五个随机0. 176平方英寸面积的光密度（红色通道）并使用Image求平 均数土SD。T检验；Pen-d/n-ATF5-RP(64小时）或者（40小时）对比生理盐水。比例尺为 10 y m〇
[0021] 图7SVZ和海马齿状回的H&E着色显示，经Pen-d/n-ATF5-RP治疗的小鼠与未经 治疗的小鼠的这些结构之间没有可以检测到的差异。（A，A'）用Pen-d/n-ATF5-RP进行第 二次皮下治疗后183天（还可参见图S8以获得同一小鼠的其他数据）时，荷瘤小鼠的侧脑 室/SVZ(A)和海马齿状回（A'）。（B，B'）未用Pen-d/n-ATF5-RP治疗也未注射逆转录病毒 的同龄对照小鼠的侧脑室/SVZ(B)和海马齿状回（B'）。（C，C'）用Pen-d/n-ATF5-RP进行 第二次皮下治疗后1天（第一次治疗后5天）时，非荷瘤小鼠的侧脑室/SVZ(C)和海马齿 状回（C'）。（D，D'）未经治疗的非荷瘤小鼠的侧脑室/SVZ(D)和海马齿状回（D'）。A-C的 比例尺为20ym，D-F的比例尺为50ym。
[0022] 图8用Pen-对照-RP肽治疗的小鼠神经胶质瘤的MRI及组织病理学实例。（A) 未注射roGF-B-HA/sh-p53逆转录病毒的对照小鼠大脑的强化后3DFLASHMRI冠状面图像。 (B)注射PDGF-B-HA/sh-p53逆转录病毒后246天且用Pen-Control-RPp印tide治疗前的 对照小鼠大脑的强化后3DFLASHMRI冠状面图像，图中显示出双侧肿瘤（白色对比）。（C) 同一小鼠用Pen-对照-RP肽皮下治疗40天后（如文中所述）大脑的强化后3DFLASHMRI 图像，图像显示肿瘤仍然存在（箭头所指）。（D)同一小鼠大脑含肿瘤区域1和含肿瘤区 2 (图像（C)中箭头所示）的H&E着色切片。由于出现濒死行为，用Pen-对照-RP肽进行第 二次治疗后116天，小鼠被杀死。两种切片都通过细胞核浓染和较高细胞细胞密度显示了 肿瘤的存在。（E)图像（C)所示区域1和区域2的切片中的HAtag免疫染色显示出在诱导 的肿瘤细胞中存在病毒传送的TOGF-B-HA。（F)图像（C)所示区域1和区域2的切片免疫 染色显示出象征肿瘤的高指数Ki67+/分裂细胞。d-f中的比例尺为20ym