些实施例中，d/n-ATF5由包含序列CTGGAACAGCGCGCGGA AGAACTGGCGCGCGAAAACGAAGAACTGCTGGAAAAAGAAGCGGAAGAACTGGAACAGGAAAACGCGGAACTGGAA GGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCGCGAACTGCGCGAACGCGCGGAAAGCTAA的核酸编码。在某 些实施例中，d/n-ATF5 肽包含序列LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRE RAESV，其中，加下划线序列为显性阴性序列，其余序列为ATF5亮氨酸拉链。在某些实施例 中，d/n-ATF5 由包含序列CTGGAACAGCGCGCGGAAGAACTGGCGCGCGAAAACGAAGAACTGCTGGAAAAA GAAGCGGAAGAACTGGAACAGGAAAACGCGGAACTGGAAGGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCGCGAAC TGCGCGAACGCGCGGAAAGCGTGTAA的核酸编码。在某些实施例中，包含ATF5亮氨酸拉链序列 LEGECQGLEARNRELRERAESV的d/n-ATF5 还将包含序列EREIQYVKDLLIEVYKARSQRTRS的 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个额外〇端厶丁卩5拉 链残基。在某些实施例中，d/n-ATF5肽由前述肽序列之一构成。
[0046] 本文所使用的"细胞穿透肽"或"CP"为一种肽，其包含短氨基酸序列（例如，在某 些实施例中，约12-30个残基）或者功能基序，这种功能基序具有能量自给（即，非胞吞方 式）迀移特性，可运送可透过膜的复合物穿越血浆和/或细胞核膜。具有这种特性的典型 氨基酸基序参见美国专利6, 348, 185，其内容以引用的方式明确并入本文。本发明的细胞穿 透肽优选包括但不局限于penetratinl、转运素、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。 [0047] 本发明的细胞穿透肽包括的那些序列保留了已确认的细胞穿透肽的某些结构特 征和功能特征，但在一个或多个位置上与已确认的细胞穿透肽的氨基酸序列不同。这种多 肽变体可使用本领域已知方法对原始序列进行取代、删除或添加氨基酸残基制得。
[0048] 在某些实施例中，这种大体类似的序列包括包含保守氨基酸取代的序列，如上文 中关于针对细胞凋亡的多肽目标抑制剂的描述。在某些实施例中，本发明的细胞穿透肽与 已确认的肽至少有大约 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %的相似性，并且能够调节细胞透性。氨基酸取代对这种合成肽调节 细胞透性能力的影响可通过下文实例部分中公开的方法进行测试。
[0049]在本发明的某些实施例中，细胞穿透肽为penetratinl，其包含肽序列 RQIKIWFQNRRMKWKK或其保守变体。本文中所使用的"保守变体"是具有一个或多个氨基酸 取代的肽，其中，所述取代对细胞穿透肽的形状一一或者由此对细胞穿透肽的生物活性（即 输送活性）或细胞膜毒性一一没有负面影响。
[0050]penetratinl是源于果蝇触角足基因同源域第三a-螺旋的16-氨基酸多肽。它的 结构和功能已得到深入的研究和特征描述：Derossi等，TrendsCellBiol.，8(2) :84_87， 1998;Dunican等，Biopolymers，60(1) :45_60,2001;Hallbrink等，Biochim.Biophys. Acta，1515 (2) :101-09,2001;Bolton等，Eur.J.Neurosci.，12(8) :2847-55, 2000;Kilk 等，Bioconjug.Chem.，12 (6) :911_16, 2001 ;Bellet_Amalric等，Biochim.Biophys.Acta， 1467(1) : 131-43, 2000;Fischer等，J.P印t.Res.，55(2) : 163-72, 2000;Thoren等，FEBS Lett.，482(3) :265-68,2000。
[0051] 已经证明，penetratinl有效携带抗生物素蛋白（一种63-kDa的蛋白质）进入 人Bowes黑色素瘤细胞（Kilk等，Bioconjug.Chem.，12(6) :911_16, 2001)。而且，已经证 明penetratinl及其携带物质的输送是非胞吞方式的且能量自给，而且不依赖于受体分子 或运输分子。此外，众所周知，penetratinl能够穿过纯脂质双分子层（Thoren等，FEBS Lett.，482(3) :265-68, 2000)。这个特点使penetratinl可以不受细胞表面受体/转运体的 限制运送所携带的物质。此前已经证明，递送载体可以进入所有类型的细胞（Derossi等， TrendsCellBiol.，8(2) :84_87，1998)，并且可以有效运送肽（Troy等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，93 :5635-40,1996)或反义寡核苷酸（（Troy等，J.Neurosci.，16 :253-61，1996; Troy等，J.Neurosci.，17 1997) 〇
[0052] 在某些实施例中，CP-d/n-ATF5是包含列的肽，该序列可操作地与 大鼠d/n-ATF5序列相连。在某些实施例，CP-d/n-ATF5肽序列为MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRQ IKIffFQNRRMKffKKDYKDDDDKMASMTGGQQMGRDPDLEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEAR NRELRERAESV,其中,加下划线残基为6XHis标签的前导序列，粗体残基为Penetratin序列， 斜体残基为Flag标签，正常字体残基为间隔氨基酸，粗斜体残基为d/n序列，加下划线粗体 残基为在第一缬氨酸后被截短的ATF5亮氨酸拉链。在某些实施例中，CP-d/n-ATF5由包含 序列ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCGTCAAATTA AAATTTGGTTTCAAAATCGTCGTATGAAATGGAAAAAAGACTACAAGGACGATGATGACAAAATGGCATCTATGACT GGAGGACAACAAATGGGAAGAGACCCAGACCTCGAACAAAGAGCAGAAGAACTAGCAAGAGAAAACGAAGAACTACT AGAAAAAGAAGCAGAAGAACTAGAACAAGAAAATGCAGAGCTAGAGGGCGAGTGCCAAGGGCTAGAGGCGCGGAATC GGGAGCTGAGGGAGAGGGCAGAGTCAGTGTAG的核酸编码。
[0053] 本发明的其他非限制性实施例包括以下示例性细胞渗透分子的使用： RL16 (H-RRLRRLLRRLLRRLRR-OH)，一种源于Penetratinl的物理性质略有不同的序列 (BiochimBiophysActa.2008Jul-Aug;1780(7-8) :948-59);以及RVGRRRRRRRRR，一种 狂犬病病毒序列，其目标神经元见P.Kumar、H.Wu、J.L.McBride、K.E.Jung、M.H.Kim、 B.L.Davidson、S.K.Lee、P.Shankar和N.Manjunath的《经血管向中枢神经系统运送小分子 干扰RNA》，《自然》杂志448 (2007)，39-43页。
[0054] 在本发明的某些替代非限制性实施例中，细胞穿透肽为一种选自包含以下各项的 集群的细胞穿透肽：转运素、pISl、Tat(48-60)、pVEC、MAP和MTS。转运素为27-氨基酸长 肽，其包含由赖氨酸连接的12个功能性氨基酸和黄蜂毒素羧基端的14-残基序列（Pooga 等，FASEBJ.，12(1) :67-77,1998)，所述12个功能性氨基酸来自神经肽甘丙肽氨基端。所 述细胞穿透肽包含氨基酸序列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL，或其保守变体。
[0055]plsl源自大鼠胰岛素1基因增强子蛋白同源域的第三螺旋（Magzoub等，Biochim. Biophys.Acta，1512 (1) :77-89, 2001;Kilk等，Bioconjug.Chem.，12(6) :911-16, 2001)。 plsl包含氨基酸序列PVIRVWFQNKRCKDKK或其保守变体。
[0056]Tat为86-102氨基酸的转录激活因子，可以穿过HIV感染细胞的质膜进行置换 以反式激活病毒基因组（Hallbrink等，Biochem.Biophys.Acta.，1515 (2) :101_09, 2001 ; Suzuki等，J.Biol.Chem.，277(4) :2437-43,2002;Futaki等，J.Biol.Chem.，276(8): 5836-40，2001)。从残基48-60延伸的Tat小片段已被确认在入核转运中起主导作用 (Hallbrink等，Biochem.Biophys.Acta.，1515 (2) :101_09,2001;Suzuki等，J.Biol. Chem.，277(4) :2437-43, 2002;Futaki等，J.Biol.Chem.，276(8) :5836-40, 2001);它包含 氨基酸序列YGRKKRRQRRR:GRKKRRQRRRPPQ或其保守变体。
[0057] 在某些实施例中，CP-d/n-ATF5为包含可操作地与大鼠d/n-ATF5序列相连的TAT_ 序列的肽。在某些实施例中，CP-d/n-ATF5 肽序列为MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLEYGRKKRRQRR RYPYDVPDYAMASMTGGQQMGRDPDLEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRERAESV, 其中，加下划线残基为6XHis标签前导序列，粗体残基为TAT序列，斜体残基为HA标签，正 常字体残基为间隔氨基酸，粗斜体残为d/n序列，加下划线粗体残基为在第一缬氨酸后被 截短的ATF5亮氨酸拉链。在某些实施例中，CP-d/n-ATF5由包含序列ATGGGCAGCAGCCATCA TCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCTCGAGTACGGCCGCAAGAAACGCCGCCAGC GCCGCCGCTATCCATATGACGTCCCAGACTATGCTATGGCATCTATGACTGGAGGACAACAAATGGGAAGAGACCCA GACCTCGAACAAAGAGCAGAAGAACTAGCAAGAGAAAACGAAGAACTACTAGAAAAAGAAGCAGAAGAACTAGAACA AGAAAATGCAGAGCTAGAGGGCGAGTGCCAAGGGCTAGAGGCGCGGAATCGGGAGCTGAGGGAGAGGGCAGAGTCAG TGTAG的核酸编码。
[0058]pVEC为源自细胞粘附分子、血管内皮钙粘蛋白的鼠科序列的18氨基酸长肽，从氨 基酸 615-632 延伸（Elmquist等，Exp.CellRes.，269(2) :237-44, 2001)。pVEC包含氨基 酸序列LLIILRRRIRKQAHAH或其保守变体。
[0059]MTS或膜转位序列是被受体蛋白识别出来的那部分肽，负责将初期转译产 品导入适宜细胞器内以进行进一步处理（Lindgren等，TrendsinPharmacological Sciences，21(3) :99_103, 2000 ;Brodsky、J.L.、Int.Rev.Cyt.，178 :277_328,1998;Zhao 等，J.Immunol.Methods，254 (1-2) : 137-45, 2001)。特定相关的MTS为MPS肽，一种病 毒gp41蛋白的狂犬病末端结构域与来自类人猿病毒40大抗原的核定位信号的嵌合 体；它代表了一种核定位信号与膜转运序列的组合，该组合内在不依赖于温度，并且起 到寡核苷酸载体的作用（Lindgren等，TrendsinPharmacologicalSciences，21(3): 99-103, 2000;Morris等，NucleicAcidsRes.，25:2730-36,1997)。MPS包含氨基酸序列 GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV或其保守变体。
[0060] 两性模型肽或MAP构成的一组肽具有作为其基本特征的螺旋两亲性以及至少四 个完整螺旋转弯的长度（Scheller等，J.PeptideScience，5(4) :185_94，1999;Hallbrink 等，Biochim.Biophys.Acta.，1515 (2) : 101-09, 2001)。不例性MAP包含氨基酸序列 KLALKLALKALKAALKLA-酰胺或其保守变体。
[0061] 在某些实施例中，上文所述的细胞穿透肽与d/n-ATF5例如通过肽键共价结合。在 某些实施例中，细胞穿透肽通过重组DNA技术可操作地连接到d/n-ATF5。例如，d/n-ATF5可 被引入到用于编码利益相关细胞穿透肽的核酸的上游（用于连接到细胞穿透肽的氨基端） 或者下游（用于连接到细胞穿透肽的羧基端）或者上游和下游。这种既包含用于编码核酸 序列的d/n-ATF5又包含用于编码核酸序列的细胞穿透肽的融合序列可用本领域已知技术 表达。
[0062] 在某些实施例中，d/n_ATF5可通过非共价结合可操作地连接到细胞穿透肽。在某 些实施例中，通过离子相互作用、疏水性相互作用、氢键或范德华力对这种非共价结合进行 调节。
[0063] 在某些实施例中，d/n_ATF5通过化学连接物可操作地连接到细胞穿透肽。这种连 接的实例通常包含选自C、N、0、S和P集群的1-30个非氢原子。连接物实例包括但不局限 于取代的烷基或取代的环烷基。可替代地，外源部分可直接连接（此时连接物为单价）到 细胞穿透肽的氨基端或羧基端。当连接物不是共价单键时，连接物可以是任何一种稳定化 学键组合，视情况包括碳-碳单键、碳-碳双键、碳-碳三键或碳-碳芳香族键，以及碳-氮 键、氮-氮键、碳-氧键、硫-硫键、碳-硫键、磷-氧键、磷-氮键和氮-铂键。在某些实施 例中，连接物包含至少20个非氢原子，并由乙醚键、硫醚键、脲键、硫脲键、胺键、酯键、甲酰 胺键、磺酰胺键、酰肼键以及芳香族键或芳杂环键的任意一种组合构成。在某些实施例中， 连接物是碳-碳单键与甲酰胺键、磺酰胺键或硫醚键的组合。
[0064] 结合总体上步骤包括分别制备细胞穿透肽成分和d/n_ATF5成分，其中，用适宜的 反应基对上述各制备过程进行修饰和衍生化以允许两者间形成键合。然后将修饰过的d/ n-ATF5与制备的用于键合的细胞穿透肽一起进行充足时间（以及在适宜的温度、pH、摩尔 比率等条件下）的培养，以在细胞穿透肽和d/n-ATF5之间形成共价键。
[0065] 本发明考虑了多肽试管内合成（例如通过化学方法或mRNA试管内转译）生成的 蛋白质及蛋白质类似物的使用。例如，ATF5及其抑制剂可通过本领域技术人员熟知的方法 合成（《肽和氨基酸分析的现代技术》（纽约：J〇hnWiley&Sons，1981) ;Bodansky，M.，《肽 合成原理》（纽约：Springer-VerlagNewYork，Inc.，1984)。可用于合成氨基酸序列和这 些序列类似物的方法实例包括但不局限于固相肽合成、溶液法肽合成以及使用任意一种商 业肽合成器的合成。本发明的氨基酸序列可含有本领域技术人员熟知的在蛋白质序列合成 中使用的偶联剂和保护基。
[0066] 本文所使用的"氨基酸残基"、"氨基酸"或"残基"包括遗传编码的氨基酸残基和非 遗传编码的氨基酸残基，例如，非遗传编码氨基酸残基或非自然氨基酸残基包括但不局限 于天然出现的手性氨基酸的D-对映体，丙氨酸（0-Ala) ;2,3_二氨基丙酸（Dpr);哌啶 甲酸（Nip);哌可酸（Pip);鸟氨酸（Orn);瓜氨酸（Cit) ;t-丁基丙胺酸（t-BuA) ;2-t-丁基 甘氨酸（t-BuG) ;N-甲基异亮氨酸（Melle);苯基甘氨酸（PhG);环已基丙氨酸（ChA);正亮 氨酸（Nle);萘基丙氨酸（Nal) ;4_氯苯丙氨酸（Phe(4_Cl)) ;2_氟苯丙氨酸（Phe(2_F)); 3-氟苯丙氨酸（Phe (3-F)) ;4_氟苯丙氨酸（Phe (4-F));青霉胺（Pen) ;1，2, 3,4-四氢 异喹啉-3-羧酸（Tic) ;0-2_噻吩丙氨酸（Thi);蛋氨酸亚砜（MS0);高精氨酸（hArg); N-乙酰赖氨酸（AcLys) ;2,4_二氨基丁酸（Dbu) ;2,3_二氨基丁酸（Dab);对氨基苯丙氨 酸（Phe(pNH2)) ;N_甲基结|氨酸（MeVal);高半胱氨酸（hCys);高苯丙氨酸（hPhe);高丝 氨酸（hSer);羟脯氨酸（Hyp);高脯氨酸（hPro);以及上述各项的对应D-对映体，例如， D-0-Ala、D-Dpr、D-Nip、D-〇rn、D-Cit、D-t-BuA、D-t-BuG、D-Melle、D-PhG、D-ChA、D-Nle、 D-Nal、D-Phe(4-C1)、D-Phe(2-F)、D-Phe(3-F)、D-Phe(4-F)、D-Pen，D-Tic、D-Thi、D-MSO、 D-hArg、D-AcLys、D_Dbu、D_Dab、D_Phe(pNH2)、D-MeVal、D-hCys、D-hPhe、D-hSer、D_Hyp和 D-hPro。其他的非遗传编码氨基酸残基包括3-氨基丙酸；4-氨基丁酸；异派啶酸（Inp); 氮杂哌啶酸（azPip);氮杂脯氨酸（azPro) ;a-氨基异丁酸（Aib) ;e-氨基乙酸（Aha); S_氨基戊酸（Ava) ;N_肌氨酸（MeGly)。
[0067] 在某些实施例中，显性阴性细胞穿透ATF5包含选自由以下各项组成的集群的序 列：(l)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRQIKIffFQNRRMKffKKDYKDDDDKMASMTGGQQMGRDPDLEQRAEELAR ENEELLEKEAEELEQE