位点2胰岛素类似物的制作方法
【专利说明】位点2胰岛素类似物
[0001 ] 关于联邦资助研究或开发的声明 本发明在资助号DK040949和DK074176下，在由美国国立卫生研究院（National InstitutesofHealth)授予的合作协议下，由政府支持进行。美国政府可能在本发明中拥 有一定权利。
[0002] 发明背景 本发明涉及多肽激素类似物，其显示出增强的药学特性，例如改变的药代动力学和药 效动力学特性，即相对于相应的野生型人激素的可溶制剂，赋予缩短的作用持续时间。更特 别地，本发明涉及含有下述的胰岛素类似物：任选与（ii)一个或多个B链取代结合的（i)在 其"位点2受体结合表面"中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个B链取代是本领域 已知加速胰岛素类似物从皮下储库吸收到血流内的。本发明的胰岛素类似物可以任选含有 在A和B链之间的连接结构域（C结构域）（并且因此描述为单链类似物)，并且可以任选含 有在A或B链中的其他位点处的标准或非标准氨基酸取代。本发明依据的基本想法是通过 在激素的位点2受体结合表面中同时掺入取代，来增强速效类似物的安全和功效。这种取 代组合赋予在作为糖尿病治疗方法的皮下注射后，血糖浓度的膳食控制中的效用的"快开/ 快关"药代动力学特性，以及在用于治疗糖尿病的的基于算法的闭环系统操作("智能栗"） 中的进一步效用。
[0003] 蛋白质包括治疗剂和疫苗的改造可以具有广泛的医学和社会利益。天然存在的蛋 白质一如人类、其他哺乳动物、脊椎动物生物、无脊椎动物生物或一般而言的真核细胞的基 因组中编码的一通常含有两个或更多个功能表面。蛋白质类似物的利益能够实现这些功能 表面之一或另一个的选择性修饰，例如以提供生物活性的细调。治疗蛋白质的实例由胰岛 素提供。野生型胰岛素的三维结构已充分表征为锌六聚体、无锌二聚体以及溶液中的分离 单体（图1和2)。在其他哺乳动物的基因组中编码的野生型人胰岛素和胰岛素分子与胰岛 素受体（IR)结合，所述IR各自含有多重结构域和相关结构域表面。IR是a0半受体(指 定为（a0 )2)的二聚体，其中a链和0链是单个前体多肽的翻译后产物。（a0 )2二聚 体的激素结合表面已分类为与受体的非线性结合和动力学特性有关的龍点7和龍点么这 种结合方案在图3中以图解形式显示。IR胞外结构域片段的结构和生物化学分析中的近期 进展已显示，位点1由通过（a0 )2二聚体中的两个亚基形成的反式结合元件组成：一个亚 基的N末端L1结构域和另一个亚基的C末端a-螺旋（aCT)(WhittakerJ，Whittaker LJ,RobertsCTJr,PhillipsNB，Ismail-BeigiF，LawrenceMC和WeissMA.a-Helical elementatthehormone-bindingsurfaceoftheinsulinreceptorfunctionsasa signalingelementtoactivateitstyrosinekinase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109,1116-71 (2012))。位点2的位置并未得到充分表征，但提议为包含第一和第二纤连蛋 白同源结构域的部分。
[0004] 胰岛素或胰岛素类似物的受体结合表面可以同样在同源的基础上进行分类：分 别的位点1结合表面(典型受体结合表面）和位点2结合表面(非典型受体结合表面)。胰 岛素的位点1结合表面重叠其在B链中的二聚体形成界面，而位点2结合表面重叠其六 聚体形成界面。位点1激素-IR界面近期已在低分辨率下显现（MeritingJG，Whittaker J,MargettsMB,WhittakerLJ,KongGK,SmithBJ,WatsonCJ,ZakovaL,Kletvlkova E,JiracekJ,ChanSJ,SteinerDF,DodsonGG,BrzozowskiAM,WeissMA,WardCff 和LawrenceMC.Howinsulinengagesitsprimarybindingsiteontheinsulin receptor.yVatore493,241-5 (2103))。假定的位点2相关残基可以基于突变的动力学效 应，或基于其中突变仍然损害结合的对于位点1外部的位置进行限定。这些标准突出显示 了非典型残基412)13)17、813和817的潜在重要性。各自的位点1相关和位点2相关表 面与图4中的胰岛素单体的表面相关显示。然而，本领域已知加速来自皮下储库的胰岛素 吸收的取代通常在激素的位点1结合表面内和与激素的位点1结合表面相邻(例如在残基 B24、B28或B29)，我们设想一万在歡激溆或级织游表琢J:/#/兹，位点2结合表面的修饰就可 以通过激素受体复合物的信号传导的细胞持续时间调节。尽管不希望受理论限制，我们进 一步设想信号传导的细胞持续时间的此类缩短对速效胰岛素类似物("快开"）赋予"快关" 药代动力学特性，所述速效胰岛素类似物在皮下储库中的分解已通过如本领域已知的在位 点1结合表面内或与位点1结合表面相邻的取代得到加速(关于原理，参见图6)。因此，此 类位点1/位点2相关取代的新型组合一起赋予在糖尿病治疗中具有新型效用的快开/快 关药代动力学特性的所需组合。
[0005] 本领域已知在胰岛素的典型受体结合表面内的修饰或取代可以使激素对于其受 体的体外亲和力损害最高达约五倍(例如从0. 05nM的解离常数到0. 25nM的解离常数)， 而对体内效力没有显著作用，如通过皮下或静脉内注射时，变体胰岛素引起血糖浓度中的 降低的能力评价的。此类稳固性至少部分归于亲和力和激素从血流中的清除速率之间的补 偿关系。因为与IR的结合介导胰岛素作用和在很大程度上的胰岛素清除两者，所以亲和 力中的降低导致循环半衰期中的成比例增加，且因此导致影响生物学信号传导的机会。此 类补偿的实例已与胰岛素类似物相关公开，在所述胰岛素类似物中，在位置B24处的苯丙 氨酸由环己基丙氨酸（Cyclohexanylalanine) (Cha)取代，公开于2012年7月13日提交 的国际专利申请序列号PCT/US12/46575和2013年1月22日提交的美国临时专利申请序 列号61/755,020中，所述专利的内容通过引用并入本文。在位置B24处的Cha的非平面 脂环（图8中举例说明的）使受体结合亲和力损害约三倍，但对KP-胰岛素的效力或药效动 力学特性没有作用，如通过在糖尿病Sprague-Dawley大鼠中测试的（图9A)。另外的实例 已通过在位置B24处经由氟-芳香族和氯-芳香族取代进行修饰而提供，如图7中举例说 明的（与野生型二聚体界面有关)，并且如分别于2012年7月18日和2011年1月31日提 交的美国专利申请序列号13/515, 192、13/018, 011，于2012年10月4日提交的美国临时 专利申请号61/709, 448,以及分别于2010年12月13日和2012年10月29日提交的国际 专利申请号PCT/US2010/60085和PCT/US2012/62423中公开的，所述专利通过引用并入本 文。在靡K[LysB2S，ProB29]_胰岛素，也指定为KP-胰岛素（Humalog?的活性组分）； EliLillyandCo.)中的PheB24通过在芳环的邻位处的单个氯取代（2_Cl_PheB24)的修饰， 因此使变体激素在体外对于经分离的IR的生物化学亲和力损害约三倍，而不改变其体内 效力，如通过在经由链脲霉素致使糖尿病的Sprague-Dawley大鼠中评价的，或如在麻醉的 非糖尿病青春期约克夏猪中评价的，在所述约克夏猪中，内源胰岛素分泌被静脉内奥曲肽 抑制(数据未显示)。甚至更引人注意地，虽然含有2-F-PheB24 (在位置B24处的邻-单氟苯 丙氨酸）的[AspB1°，LysB2S，ProB29]-胰岛素（DKP-胰岛素）的衍生物显示出受体结合亲和力 中的相似减少量(相对于KP-胰岛素约35 ( ±5) %)，其效力和信号传导持续时间在糖尿病 Sprague-Dawley大鼠中得到增强（图9B)，如于2011年1月31日提交的美国专利申请序列 号13/018, 011 (其通过引用并入本文）中公开的。因此，预期如在体外评估的，一般在胰岛 素分子中对IR结合引入适度扰乱的修饰或取代在体内将是良好耐受的，并且就效力或(在 不存在对自装配的作用的情况下）其他药理学特性而言，与野生型胰岛素无法区别一或甚 至更有效力和如在2-F-PheB24-DKP-胰岛素的情况下延长的。因此出乎意料地发现在位点2 内的取代或修饰可以显著缩短体内胰岛素作用的持续时间（药代动力学的改变)，尽管对变 体胰岛素关于IR的生物化学亲和力赋予的扰乱小于五倍。尽管在位置B13、B17、A12、A13 和A17处的侧链不被认为在胰岛素受体的主要激素结合表面处衔接，但丙氨酸扫描诱变已 显示在位点2相关位置处的单个丙氨酸取代如下影响相对受体结合亲和力：（位置B13) 12 (±3)%、（B17)62 (±14)%、（A12)108 (±28)%、（A13)30 (±7)% 和（A17)56 (±20)%。
[0006] 胰岛素施用长久以来已确定为糖尿病的治疗。在患有糖尿病的患者中的常规胰岛 素替代疗法的主要目标是血糖浓度的紧密控制，以阻止其偏移高于或低于健康人主体特有 的正常范围。偏移低于正常范围与立即肾上腺素或神经低糖（neuroglycopenic)症状相 关，其在严重发作中导致抽搐、昏迷和死亡。偏离高于正常范围与微血管疾病的长期危险增 加相关，所述微血管疾病包括视网膜病变、失明和肾衰竭。胰岛素是在脊椎动物的代谢中起 关键作用的小型球状蛋白质。胰岛素含有两条链：含有21个残基的A链和含有30个残基 的B链；各个残基通过氨基酸的身份(通常使用标准三字母代码)、链和序列位置(通常为上 标)指出。激素作为Zn2+稳定六聚体贮存于胰细胞，但在血流中充当无Zn2+单体。胰岛 素是单链前体胰岛素原的产物，其中连接区（35个残基)将B链的C末端残基(残基B30)与 A链的N末端残基连接。各种证据指出它由胰岛素样核心和无序的连接肽组成。三个特异 性二硫桥（A6 -All