3，4-二羟基苯甲醛制备治疗或/和预防脑缺血再灌注损伤的药物的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及3,4_二羟基苯甲醛用于制备治疗或/和预防脑缺血再灌注损伤的药 物的用途，属于医药领域。
【背景技术】
[0002] 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑 功能障碍，称为脑缺血再灌注（cerebral ischemia-reperfusion，CIR)损伤。目前，抑制再 灌注损伤已成为治疗缺血性脑血管病的重要环节。
[0003] 脑缺血再灌注损伤是一种复杂的病理生理过程，主要与自由基过度形成、兴奋性 氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、炎性反应等多种机制有关。近年来针对脑缺血再灌注损伤 的治疗研究已取得一定成效，临床上往往采用亚低温治疗、抗炎治疗、抑制细胞凋亡等手段 联合治疗，共同减轻脑损伤（陈玉敏等，脑缺血再灌注损伤机制与治疗现状[J]，医学研究 与教育，2012, 29:47-54)。然而，由于病因较多、发病机制复杂，防治脑缺血再灌注损伤尚缺 乏有效的药物和方法，研制有效的药物迫在眉睫。
[0004] 3,4_二羟基苯甲醛（又名原儿茶醛）是一种重要的医药中间体，可用于合成多种 抗菌素和消炎药物，广泛存在于天然产物中（如天麻、丹参等），并且可以通过简单的工艺 步骤制备得到。近年来对原儿茶醛药理活性及其作用机制等方面的研究表明，它具有抗动 脉粥样硬化、保护心肌、抗血栓形成、神经保护、抗脓血、抗病毒、抗纤维化等广泛的药理活 性（张翠英等，原儿茶醛的药理研究进展[J]，中国实验方剂学杂志，2014,19 (23) :338~ 342) 〇
[0005] 然而，迄今尚未有关于3,4_二羟基苯甲醛具有防治脑缺血再灌注损伤药理作用 的公开报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供3,4-二羟基苯甲醛用于制备治疗或/和预防脑缺血再灌 注损伤的药物的用途。
[0007] 本发明提供了 3,4-二羟基苯甲醛用于制备治疗或/和预防脑缺血再灌注损伤的 药物的用途。
[0008] 进一步的，所述的药物是治疗或/和预防神经功能损伤、血脑屏障损伤或一氧化 氮（N0)毒性反应中一种或几种疾病的药物。
[0009] 更进一步的，所述的药物是下调脑组织Caspase-3、Caspase-9、AQP-4或MMP-3中 一种或几种蛋白表达的药物；所述的药物是升高脑组织Occludin、Claudin-5或GFAP中一 种或几种蛋白表达的药物；所述的药物是降低脑组织中N0含量的药物；所述的药物是抑制 神经型一氧化氮合酶（nNOS)、诱导型一氧化氮合酶（iNOS)中一种或两种酶活性的药物。
[0010] 进一步的，所述的药物是由有效量的3,4_二羟基苯甲醛为活性成分，加入药学上 可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
[0011] 优选的，所述的制剂为口服制剂。
[0012] 优选的，所述的制剂为胶囊剂、颗粒剂或片剂。
[0013] 本发明还提供了一种治疗或/和预防脑缺血再灌注损伤的药物组合物，它是以3， 4-二羟基苯甲醛为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
[0014] 进一步的，所述制剂为口服制剂。
[0015] 更进一步的，所述口服制剂为胶囊剂、颗粒剂或片剂。
[0016] 本发明提供了 3,4_二羟基苯甲醛用于制备治疗或/和预防脑缺血再灌注损伤的 药物的用途。药效实验表明，该化合物具有显著的保护血脑屏障、保护神经功能及抑制N0 毒性反应发生的作用，从而达到治疗或/和预防脑缺血再灌注损伤的效果。相较于目前临 床上常用的同类药物和治疗手段，3,4-二羟基苯甲醛来源广泛、价格低廉、疗效显著，具有 良好的临床应用前景。
[0017] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0018] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0019] 图1EB标准曲线。
[0020] 图2 BCA法测定蛋白浓度的标准曲线
[0021] 图3 nNOS试剂盒的标准曲线
[0022] 图4 iNOS试剂盒的标准曲线
[0023] 图5 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠脑组织EB含量的影响
[0024] 图6 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠脑组织EB渗出情况的影响
[0025] 图7 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠缺血侧脑组织AQP-4表达的影响
[0026] 图8 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠缺血侧脑组织Occludin表达的影响
[0027] 图9 3,4-二羟基苯甲醛对大鼠缺血侧脑组织(：1 &11乜11-5表达的影响
[0028] 图10 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠缺血侧脑组织MMP-3表达的影响
[0029] 图11 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠缺血侧脑组织GFAP表达的影响
[0030] 图12 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠神经病学评分的影响
[0031] 图13 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠缺血侧脑组织Caspase-3表达的影响
[0032] 图14 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠缺血侧脑组织Caspase-9表达的影响
[0033] 图15 3, 4-二羟基苯甲醛对大鼠脑组织N0含量及N0S活性的影响
【具体实施方式】
[0034] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、试剂及设备均为已知产品，通过购买市售产 品获得。
[0035] 以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0036] 1.实验材料
[0037] 1· 1实验动物
[0038] 成年健康雄性SD大鼠，体重250_300g，SPF级，由四川省医学科学院实验动物研究 所提供，生产许可证号：SCXK(川）2008-24,合格证号：0017670。
[0039] 1.2实验药品
[0040] 3,4_二羟基苯甲醛，由中科院昆明植物研究所从天麻EtOAc层提取物中分离精制 而得的透明状的固体结晶，结构确定后本实验所用的是购自美国Sigma公司的单体成分。
[0041] 此外，也可以采用文献报道的其他方法从含有3,4_二羟基苯甲醛的植物（如丹 参）中提取3,4-二羟基苯甲醛；或者直接购买市售产品（CAS号：139-85-5)。
[0042] 1. 3主要试剂配制
[0043] 1.3.10.9%生理盐水的配制：氯化钠4.58，加双蒸水至50〇1^，充分摇匀放4°(：冰 箱备用。
[0044] 1. 3. 2生理盐水（0. 9% )加肝素（5单位/ml)溶液的配制：量取0. 9%生理盐水 1000mL，滴加2500U肝素800uL，充分摇匀放4°C冰箱备用。
[0045] 1. 3. 3 2% EB溶液的配制：精密称取EB2g，加入生理盐水容量瓶中定容至100mL， 搅拌至完全溶解。
[0046] 1. 3. 4肝素化生理盐水灌注液：氯化钠（分析纯）9g，注射用肝素钠25000U以蒸馏 水800mL完全混溶后以定容瓶定容至1000mL，分装于500mL无菌瓶中备用。
[0047] 1. 3. 5电镜心脏灌流固定液的配制（4%多聚甲醛+0. 5%戊二醛）：溶解2g多聚甲 醛于25mL双蒸水中，80°C水浴，摇动使之溶化后加1-3滴NaOH(lM)，使溶液澄清。冷却后加 lmL 25 %戊二醛（电镜专用），再加24mL的PBS (0· 2M)，调pH备用。
[0048] 1. 3. 6Western_Blot实验中所需配制的试剂
[0049] 1. 3. 6. 1 10 %过硫酸胺（AP)
[0050] 过硫酸胺0· lg
[0051] 蒸馏水lmL
[0052] 现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1. 5mL离心管中（一次性多称几 管-20°C保存备用），加入蒸馏水溶解即可，1周内可以用完的放入4°C保存，将剩余的分装， 放入-20°C冰箱保存。
[0053] 1. 3. 6. 2 4X 上样缓冲液（Loading buffer)
[0054] 1.0 moL/L TrisMICLipUB. 8) 2mL· SDS 0.8g 溴酚蓝 0.04g 甘油 4mL
[0055] 去离子水定容至10mL。混勾后，分装于1. 5mL离心管中，每个lmL，4°C保存。使用 时稀释成IX。
[0056] 1. 3. 6. 3 1. 0moL/L 二硫苏糖醇（DTT) (10X)
[0057] 用20mL 0. 01moL/L乙酸钠溶液（pH5. 2)溶解3. 09g DTT，分装成lmL小份储存 于-20 °C，使用时稀释成IX。
[0058] 例如：上样量20 μ L-4X上样缓冲液5 μ L+DTT 2 μ L+样本蛋白13 μ L
[0059] 1· 3· 6· 4 5X电泳液缓冲液
[0060] Tris (Ml21. 14) 15. lg 甘氨酸(MW75. 07) 94g SDS 5g 蒸馈水.午：