促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物医药生物工程领域，尤其是一种促进畜禽生长的粒细胞-集落刺 激因子GM-CSF基因与生长抑素 SS基因共表达DNA疫苗PIRES-GM-CSF/2SS的方法。
【背景技术】
[0002] 对于肉用的动物来说，生长速度、产肉率、饲料利用率等是衡量肉用动物的主要指 标，可以从营养方面调控，也可以从生长发育方面调控。
[0003] 动物的生长轴是由动物体内下丘脑-垂体-靶器官及其相关的激素和受体 所组成的具有自动调节的神经内分泌系统。下丘脑释放生长激素释放因子（Growth hormone-releasing factor，GRF)、生长抑素（Somatostatin，SS)等相关的激素，但是最重 要的是GRF和生长激素 （Growth hormone，GH)。其中GRF是促进垂体释放生长激素，进而 促进动物的生长。而SS则是抑制垂体释放GH，也就是说其具有抑制动物生长的作用。接 着GH又可以直接作用于靶器官，或者通过肝脏分泌的胰岛素样生长因子（Insulin-like growth fact〇rs，IGFs)再作用于靶器官，这就是动物生长轴的机理。动物的生长受到很多 激素的调节，但是最重要的是GRF和SS，含有SS的生长抑素基因疫苗表达产生的抗体中和 内源性SS，间接使GRF激素的分泌含量增加，从而促进畜禽的生长；粒细胞-集落刺激因子 (GM-CSF)是一种具有多项潜能的造血生长因子，在细胞因子网络中占有重要地位，具有免 疫增强作用，能增强生长抑素 DNA疫苗的免疫效果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗 PIRES-GM-CSF/2SS的方法，该基因疫苗一次注射，能同时表达出SS和GM-CSF两个完全独立 的蛋白，从而减少了工作量及对免疫动物的应激影响，能保持独立的免疫原性，增强了免疫 效果。
[0005] 本发明的目的是这样实现的： 一种促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方 法，特征是：具体步骤如下： A、 将pIRES (共表达质粒载体）质粒用I和及I进行双酶切，以pVGS/2ss-asd 质粒为模板，PCR获取猪GM-CSF基因，胶回收GM-CSF基因与T载体进行连接反应，构建阳 性重组质粒pIRES-GM-CSF ; B、 以pVGS/2ss-asd质粒为模板，用和III进行双酶切，PCR获取猪SS基因， 用Abi I和I进行双酶切与T载体进行连接反应，构建T2SS质粒； C、 采用Abi I和I内切酶分别酶切pIRES-GM-CSF质粒和T2SS质粒，将纯化、回收 的pIRES-GM-CSF大片段和2SS片段进行连接反应，构建真核表达质粒pIRES-GM-CSF/2SS， 得到DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS (GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗)。
[0006] pIRES-GM-CSF/2SS疫苗是在真核表达载体pIRES的MCS A和MCS B两个多克隆位 点分别插入GM-CSF和SS基因，在真核动物中可同时独立表达出完全独立的GM-CSF和SS 蛋白，可用来促进畜禽生长。
[0007] PIRES-GM-CSF/2SS疫苗采用一次注射，它能同时表达出SS和GM-CSF两个完全独 立的蛋白，从而减少了工作量及对免疫动物的应激影响，能保持独立的免疫原性，增强了免 疫效果。
【附图说明】
[0008] 图1为本发明的pIRES-GM-CSF/2SS质粒的构建图。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
[0010] 一种促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗PIRES-GM-CSF/2SS 的方法，具体步骤如下： 1共表达基因疫苗PIRES-GM-CSF/2SS的构建及鉴定方法(技术路线见图1) 1.1引物的设计与合成 采用Primer 5. 0软件设计引物，分别根据猪的GM-CSF序列和2SS片段(含有乙肝表面 抗原S基因）序列设计扩增GM-CSF和2SS片段的引物(见表1)，设计引物由上海生物工程 有限公司合成。
[0011] 1.2 pIRES质粒的提取与酶切 将pIRES质粒转入感受态大肠杆菌A cWi DH5a中，铺板与扩大培养后挑取单菌落进 行培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒pIRES，然后进行酶切，酶切体系为：10 XM buffer 1. 0 μ L、ZAa I 0· 2 μ L、方coR I 0· 2 μ L、pIRES 质粒 2 μ L、ddH20 至总体积 10 uL，37 °C，反应2-3 h，酶切后，用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
[0012] 1. 3 pIRES-GM-CSF 质粒的构建 1.3. 1 GM-CSF基因的扩增 按试剂盒说明书抽提和纯化pVGS/2SS-asd质粒。以pVGS/2SS-asd质粒为模板，按照 如下PCR反应体系进行GM-CSF基因的扩增：5XBuffer 2 yL、d NTP 0. 4 yL、Taq DNA聚 合酶 0.4 yL、引物 pl、p2 各 0.5 yL、pVGS/2SS-asd质粒 L5 yL、ddH20 至合计 20 yL。 按以下条件进行PCR反应：94 °C变性6 min，然后，94 °C变性1 min、51 °C退火1 min、72 。(:延伸1 min，35个循环后72 °C续延10 min、16 °C降温5 min。PCR产物1.0 %琼脂糖电 泳检测，胶回收，纯化和定量，备用。
[0013] 1. 3. 2 GM-CSF基因与T载体相连 按照如下连接体系将GM-CSF基因与T载体进行相连：PCR的产物GM-CSF 4 μ L、T-载 体1 yL，35 °C反应15 min，将反应产物转化感受态DH5a中，培养后，采用质粒提取试剂盒 提取质粒TGM-CSF质粒。然后按以下酶切体系进行酶切鉴定：T-GMCSF质粒2 I 0.1 yL、方coR I 0.3 yL、10X M Buffer 1 yL、加 dd H20 至总体积 10 yL，鉴定正确的 质粒送往北京奥科生物技术有限公司测序，备用。
[0014] 1.3.3 pIRES-GM-CSF 质粒的构建 纯化后的pIRES质粒和TGM-CSF质粒分别用船e I和I双酶切，酶切体系分别为： pIRES 质粒 12 I 0.4 yL、此oR I 0.8 yL、10XM Buffer2 yL、加 dd H20 至总 体积20 yL;TGM-CSF 12 μL、Λ*??Ι 0.2 yL、方coR I 0.2 yL、10XM Buffer 2 yL、加 dd H20至总体积20 μ L，37 °C，反应2-3 h，酶切后，用1.0 %琼脂糖凝胶电泳，分别分离回收 pIRES大片段和GM-CSF片段，备用。
[0015] 然后，将回收、纯化的PIRES大片段和GM-CSF片段按如下体系进行连接反应： pIRES 载体线性片段 1 yL、GM-CSF 线性片段 4 yL、5XT4LigaseBuffer2 yL、T4DNA Ligase 1 yL、ddH20 2 yL、共计 10 yL，23°C 水浴，连接 20min〇
[0016] 1· 3· 4阳性重组质粒（pIRES-GM-CSF)的筛选和鉴定 将连接产物转化感受态A cWi DH5a细菌，固体培养基铺板培养，挑取阳性克隆，LB培 养，提取质粒DNA，进行酶切鉴定，酶切体系为：阳性克隆2 I 0. 1 yL、此〇R I 0.3 yL、10XM Buffer 1 yL、dd H20 至总体积 10 yL，37 °C，反应 2-3 h，1.0 % 琼脂糖 电泳检测，电泳条带与目的条带大小相符，鉴定正确的质粒送往北京奥科生物技术有限公 司测序，获得的阳性克隆命名为PIRES-GM-CSF。
[0017] 1. 4 PIRES-GM-CSF/2SS 质粒的构建 1.4. 1 2SS基因的扩增 以pVGS/2SS-asd质粒为模板，按照如下PCR反应体系进行SS基因的扩增：5XBuffer 2 yL、dNTP0.4 yL、TaqDNA 聚合酶 0.4 yL、引物 p3、p4 各 0.5 yL、pVGS/2SS-asd 模板1. 5 μ L、ddH20至总体积20 μ L，按以下条件进行PCR反应：94 °C变性6 min，然后 94 °C 变性 1 min、54.9 °C 退火 1 min、72 °C 延伸 1 min，35 个循环后，72 °C 续延 10 min、 16 °C降温5 min，PCR产物1. 0 %琼脂糖电泳检测，胶回收，纯化和定量，备用。
[0018] 1.4.2 T2SS质粒的构建 将2SS的PCR产物与T