刺激毛发生长或防止毛发脱落的包括神经干细胞的提取物的组合物及其制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于刺激毛发生长或防止毛发脱落的组合物及其制备方法，所述组合物含有神经干细胞的提取物。更具体地，本发明涉及外胚层神经干细胞的条件培养基或外胚层神经干细胞的提取物的新用途，以及一种用于刺激毛发生长或防止毛发脱落的组合物，其中包含从人脑的脑室区分离的经培养的神经干细胞(NSC)的条件培养基或提取物。
【背景技术】
[0002]毛发遵循特定的毛发周期。将毛乳头周围的角质细胞分裂和增殖的阶段称为“生长期”。生长期之后是退行期，其中毛发停止其生长并从毛乳头分离。退行期后是休止期，其中角质细胞不生长并且在一段时间后毛发会脱落。毛发周期由重复的生长期、退行期和休止期组成。成人的生长期通常因个体而不同，但已知的是，男性生长期为3-5年而女性为4-6年，并且约15%的毛发处于退行期和休止期。人类毛发遵循独立的毛发周期，并在一侧生长而会在另一侧脱落，使得毛发的总数保持相同数量。此毛发脱落被称为生理性毛发脱落。然而，除了正常的毛发周期的休止期以外，疾病、毛发护理产品(凝胶，蜡等)、压力等可引起毛发脱落，并且在这种情况下，当原因被去除时，毛发再次恢复生长。
[0003]秃头并不意味着毛发脱落后不再生长。在秃头的情况下，毛发逐渐变得更薄，并转变成毫毛。随着这种现象发展，在发根的毛乳头变小。当毛乳头变小时，毛发的厚度也变薄，并且同时，毛发周期变得更短，新生长的毛发变得更薄。随着秃发持续发展，毛发转变为毫毛，且毛发周期变短，使毛发脱落比生长快。此外，不同于已知是由自身免疫性疾病引起的斑秃，以及由内分泌疾病、营养缺乏、药物、或身体和心理压力，如生育引起的临时性毛发脱落，秃头趋于被继承，并且秃头程度是多样的。此外，已知的是秃头与血液雄性激素(雄激素)相关联。
[0004]目前，已知的是，当在毛发脱落的初始阶段使用口服药物米诺地尔(Minoxidil)和口服药物保法止(Propecia，非那雄胺成分)时，毛发脱落的进展可以有一定延迟。然而，已经发展到毛发脱落阶段的毛发难以恢复到正常状态，并且在这种情况下，可以考虑毛发移植。在毛发移植中，通过切口法或从耳部以上的侧毛发和背部毛发(非切口法)收集约1000-3000根毛发，它们对激素较不敏感，并且移植所收集的毛发。然而，毛发移植的数量是有限的。
[0005]已知目前市售产品对防止毛发脱落起作用，但对毛发生长的效果不显著。另外，当停止使用这些产品时，问题再次出现。此外，这些产品是在成本方面有劣势。
[0006]在最近几年，已经开发出利用干细胞，采用治疗毛发脱落的基因和方法来治疗毛发脱落。在涉及本发明的背景的现有技术文献中，韩国专利号10-0771171 (2007年10月29日授权)公开了一种方法，包括分离并增殖毛囊干细胞，并允许细胞分化成毛囊细胞，以及用于治疗秃发的组合物，并且韩国专利特开公开号10-2008-0097593(2008年11月6日公布)公开了通过适当地混合脂肪来源的干细胞与毛囊干细胞来制备的细胞治疗剂。此外，韩国专利号10-1218101 (2013年1月3日授权)公开了用于刺激毛发生长以及防止毛发脱落的组合物，它包含羊膜胎儿间充质干细胞的条件培养基作为活性成分。然而，尚未见报道用于刺激毛发生长或防止毛发脱落的组合物，其含有神经干细胞的条件培养基或神经干细胞的提取物，并具有优异的效果，。
[0007]因此，本发明人通过应用人毛乳头细胞(hDPC)的条件培养基或提取物，表征了神经干细胞的条件培养基或神经干细胞的提取物，并通过使用C57BL/6小鼠发现了条件培养基或提取物在体内对刺激毛发生长或防止毛发脱落的效果，从而完成了本发明。
[0008][现有技术文献]
[0009][专利文献]
[0010]专利文献1:韩国专利号10-0771171 (2007年10月29日)
[0011]专利文献2:韩国专利公开号10-2008-0097593(2008年11月6日)
[0012]专利文献3:韩国专利号10-1218101 (2013年1月3日)
【发明内容】
[0013]本发明的一个目的是提供用于刺激毛发生长或防止毛发脱落的组合物，其含有神经干细胞的条件培养基或神经干细胞的提取物。
[0014]本发明的另一个目的是提供一种制备用于刺激毛发生长或防止毛发脱落的组合物的方法，该方法包括使用神经干细胞。
[0015]本发明这些和其它的目的、特征和优点将从以下的详细说明、所附的权利要求书和附图中变得更加清楚。
【附图说明】
[0016]图1示出为测量根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自的总蛋白质含量所执行的Brad-ford测定法的结果。
[0017]图2a和2b示出通过WST-1测定法和相差显微镜，分析用根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自进行处理的毛乳头细胞的活力和形态的结果。
[0018]图3示出通过WST-1测定法分析用根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自进行处理的毛乳头细胞的增殖的结果。
[0019]图4a至4e示出qRT_PCR和RT-PCR的结果，表明用根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自进行处理时，在毛乳头细胞中的各种生长因子和细胞因子(Wnt5a、BMP2、TGF-β 2等)的表达水平增加。
[0020]图5a和5b示出qRT_PCR的结果，表明根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自使诱导毛发周期的生长期的瘦素和细胞因子Shh(Sonichedgehog)的表达水平增加。
[0021]图6a和6b示出qRT_PCR的结果，表明根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自使诱导毛发周期的退行期的TGF-β 1(转化生长因子β 1)和IL-6的表达水平被抑制。
[0022]图7a和7b是照片，示出当将根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自施用至剃毛小鼠一定时间后，刺激剃毛小鼠的毛发生长。
[0023]图8a至8c示出剃毛小鼠的毛发长度和重量，表明当将根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自施用至剃毛小鼠一定时间后，刺激剃毛小鼠的毛发生长。
[0024]图9a和9b示出H&E (苏木精和曙红)染色的结果，表明当应用根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物每种时，诱导毛囊的生长。
[0025]图10a和10b示出免疫组织化学的结果，表明当将根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，剃毛小鼠的细胞生长增加。
[0026]图11示出qRT-PCR的结果，表明当将根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，在剃毛小鼠组织中的毛乳头细胞标记物碱性磷酸酶(Akp)的表达增加。
[0027]图12示出qRT-PCR的结果，表明当将根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，在剃毛小鼠毛囊中的BMP家族(抑制干细胞分化)的表达水平降低。
[0028]图13示出qRT-PCR的结果，表明当将根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，Tmeffl (抑制BMP的表达)的表达水平和TGF- β 2 (增加Tmeffl的表达)的表达水平都增加。
[0029]图14示出免疫组织化学的结果，表明当将根据本发明的神经干细胞的条件培养基和神经干细胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，在剃毛小鼠毛囊中由BMP降低所引起的干细胞(⑶34+)的分化程度。
【具体实施方式】
[0030]在一个方面，本发明涉及一种用于刺激毛发生长或防止毛发脱落的组合物，其含有神经干细胞的条件培养基或神经干细胞的提取物。
[0031]在本发