一种生物免疫抑制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，更具体地，涉及一种生物免疫抑制剂。
【背景技术】
[0002] 免疫抑制剂（immunosuppressant，ISA)是一类具有免疫抑制作用的药物，主要功 能为抑制机体异常的免疫反应，从而达到治疗自身免疫性疾病、抗肿瘤、抗器官移植排斥以 及抗炎等目的。免疫抑制剂主要的作用机理是通过抑制与免疫反应有关细胞（T细胞和B细 胞等免疫细胞）的增殖和功能，达到降低机体的免疫反应的目的。
[0003] 免疫抑制剂大致可分为四代，第一代是以肾上腺皮质激素、雷公藤多苷片、硫唑嘌 呤和抗淋巴细胞球蛋白为代表的激素类药物；第二代是以环孢素和他克莫司为代表的细胞 因子合成剂类药物；第三代是以单克隆抗体雷帕霉素(抗T淋巴细胞单克隆抗体)、霉酚酸 月旨（MycophenolateMofetil，MMF)为代表的信号通路抑制剂类药物；第四代是以抗IL-2受 体单克隆抗体为代表的细胞因子调节剂类药物。以上四代的免疫抑制剂药物在使用过程中 均有一定的毒性，且都可以增加宿主对感染和肿瘤的易感性；另外也无法抑制慢性排斥反 应，是移植器官难以在宿主体内长期稳定存活的主要原因。
[0004] 研究发现，多数的自身免疫性疾病的发生机制来源于机体过度的免疫反应。其中， T细胞亚群依赖性自身免疫紊乱在过度免疫反应中起着重要作用，因此从免疫调节方面，纠 正失衡的免疫应答已经成为很多自身免疫性疾病治疗的方向。寄生虫这样的低等生物，在 和宿主长期共进化的过程中，为了在宿主体内存活，能够主动调节宿主免疫应答，诱导宿主 的免疫耐受，从而逃避宿主的免疫应答。流行病学及实验证据提示寄生虫感染可以降低自 身免疫性疾病的发生风险。同时，国内外现在也有很多报道提示寄生虫感染在很多自身免 疫性动物模型如结肠炎、关节炎、糖尿病方面具有很好地保护作用，可以抑制这些自身免疫 性疾病的发生和发展，具有确定的治疗效果。然而，寄生虫感染属于高致病性感染，虽然直 接应用寄生虫(如血吸虫）去治疗自身免疫性疾病面临伦理学的挑战和致病的风险，不可能 应用于临床，但是从寄生虫中寻找和发现虫源性免疫调节分子，从寄生虫纯化或人工合成 免疫调节产品仍然具有可能和广泛的临床应用前途。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种生物免疫 抑制剂。
[0006] 本发明的第二个目的是提供含有上述生物免疫抑制剂的药物。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的： 一种生物免疫抑制剂，所述生物免疫抑制剂的活性成分是氨基酸序列如SEQIDN0 :1 所示的蛋白。
[0008] 现有技术中曾报道sj16蛋白具有免疫抑制的作用，但由于sj16蛋白在使用的时 候需要进行重组表达、纯化等一系列步骤，操作繁杂，且蛋白的表达量会影响其使用。
[0009] 发明人在前期研究的基础上，通过生物学信息分析获得2段Sjl6蛋白的核定位序 列，其中，通过进一步研究发现有且仅有一段核定位序列具有真正的免疫抑制的作用。
[0010] 优选地，本发明所述生物免疫抑制剂还包括药学上可接受的辅剂。
[0011] 优选地，所述生物免疫抑制剂的剂型为散剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、片剂或注射 剂。
[0012] 优选地，本发明所述生物免疫抑制剂剂可用于制备注射用制剂、口服制剂或缓释 齐丨J等等。
[0013] 本发明还提供Sjl6多肽NLS59 79在制备免疫疾病治疗药物中的应用。
[0014] 优选地，所述免疫疾病是指自身免疫疾病；更优选地，所述自身免疫疾病为免疫移 植反应、肿瘤、器官特异性自身免疫病、自身免疫性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肠炎、 系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎或韦格纳肉芽 肿病。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种生物免疫抑制剂，所述生物免疫抑制剂的活性成分是氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示的蛋白；所述蛋白具有高效的抗炎作用，能够抑制各种自身免疫疾病，且 与各种宿主之间同源性较低，毒副作用较低，安全性较高；同时，该蛋白可与药学上可接受 的辅剂搭配制备成药物，具有广阔的市场空间和较好的社会、经济效益。
【附图说明】
[0016] 图1为Motifsan分析Sj16核定位序列图。
[0017] 图2为荧光显微镜下观察pEGFP-Nl_Sjl6融合蛋白在Hela细胞中的分布。
[0018] 图3为定量分析pEGFP-Nl空载体、pEGFP-Nl-sjl6融合蛋白及相应的5种核定位 序列突变体。
[0019] 图4为NHS荧光染料标记的rSjl6及突变体蛋白，加入BMDC孵育6h后在细胞的 定位。
[0020] 图 5 为Sjl6 蛋白免疫血清western-blot识别rSjl6 及Sjl6peptideNLS59 79相 关的三个突变体蛋白。
[0021 ] 图6为重组pGEX-4T-l-Sj16及突变体表达融合蛋白的SDS-PAGE图；1 :蛋白marker;2_ 无IPTG诱导的pGEX-4T-l-rSjl6 ;3-IPTG诱导后的pGEX-4T-l-rSjl6 ;4_ 无 IPTG诱导的pGEX-4T-l-rSjl6/ANLSMl;5-IPTG诱导后的pGEX-4T-l-rSjl6/ANLSMl; 6-无IPTG诱导的pGEX-4T-l-rSj16/ΛNLSM2 ;7-IPTG诱导后的pGEX-4T-l-rSj16/ΛNLS M2;8-无IPTG诱导的pGEX-4T-l-rSjl6/ΛNLSM3;9-IPTG诱导后的 pGEX-4T-l-rSjl6/ΔNLSM3〇
[0022] 图7为Sjl6核定位序列相关合成肽质谱分析。
[0023] 图8为Sjl6核定位序列合成肽对LPS诱导的小鼠BMDC产生的细胞因子IL-10、 IL-12的影响；其中，合成肽和多肽是指根据Sjl6的核定位序列合成PiS，其氨基酸序 列：KRSFRKGRHHIYKVMDKYIRK;截断肽是Sjl6序列去除两端碱性氨基酸的截断肽PD序列： SFRKGRHHIYKVMDKYI;LPS的浓度为 1. 0μg/ml;sjl6的浓度为 10. 0μg/ml。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语 与本领域技术人员熟悉的意义相同。
[0025] 实施例1 生物信息学分析提示Sj16蛋白具有两段核定位序列，分别是Sj16多肽NLS59 79和Sj16 多肽NLS95 1(]7 (图1)，为确定哪一簇在决定Sjl6的核定位中更重要，也为了要知道这个NLS 序列是属于哪一类，构建了五个分别突变每簇碱性氨基酸的克隆(表1)，分别是Sjl6多肽 NLS59 79:pEGFP-Nl-Sjl6ANLSMl，pEGFP-Nl-Sjl6ANLSM2 和pEGFP-Nl-Sjl6ANLSM3， 和Sjl6 多肽NLS95 107:pEGFP-Nl-Sjl6ΛNLSM4,pEGFP-Nl-Sjl6ΛNLSM5,将上述 5 中突 变体分别转染hela细胞，结果表明：pEGFP-Nl-Sjl6ANLSMl，pEGFP-Nl-Sjl6ANLSM2 和pEGFP-Nl-Sjl6ΛNLSM3与核定位序列有关的氨基酸突变后，pEGFP产生的绿色荧光信 号大多数定位于细胞浆内，细胞核中基本无绿色荧光信号；而pEGFP-Nl-Sjl6ΛNLSM4， pEGFP-Nl-Sjl6ΛNLSΜ5与核定位序列有关的氨基酸突变后，pEGFP产生的绿色荧光信号 大多数定位于细胞核内，细胞浆中基本无绿色荧光信号（图2)。可见Sjl6多肽NLS59 79具有 引导Sjl6入核的功能，是真正的核定位序列。
[0026] 进一步，成功构建pGEX-4T-l-Sjl6 突变体pGEX-4T-l-ΛNLSMl、 PGEX-4T-1-ANLSM2、pGEX-4T-l-ANLSM3,采用Western-blot(图 5)和SDS-PAGE(图 6)对重组表达的Sjl6突变体蛋白进行鉴定，NHS染料标记的Sjl6突变体蛋白在6h大都分 布于细胞浆（图4)。由以上可见Sjl6多肽NLS59 79在引导Sjl6靶向入核中起重要作用。
[0027] 实施例2 根据日本血吸虫Sjl6多肽NLS59 79的氨基酸序列（如SEQIDN0 :1)，利用人工氨基酸 合成的方法合成Sjl6多肽NLS59 79,Sjl6核定位序列相关合成肽质谱分析结果提示Sjl6核 定位序列相关合成肽序列正确（图7)。
[0028] 实施例3 Sjl6多肽NLS59 79作用于小鼠骨髓来源树突状细胞，同时做LPS和环孢素A刺激做对 比，结果发现：空白对照组对MHC-II、CD80、CD86和CD40的抑制率分别为17. 6%，29. 6%， 31. 5%，29. 7%;LPS组抑制率分别为 67. 6%，79. 6%，46. 5%，39. 2%;rSj16 多肽NLS59 79组抑 制率分别为25. 4%，31. 9%，19. 2%，19. 7% ;环孢素A组抑制率分别为27. 2%，28. 9%，17. 8%， 20. 1% ;此结果相对环孢素A更有优势，因此，Sj16多肽NLS59 79可明显抑制DC表面标记分 子MHC-II、CD40、CD80 和CD86 的表达。
[0029] 同时，Sjl6多肽NLS59 79介导的BMDC细胞也能有效抑制T细胞的增殖。利用Sjl6 多肽NLS59 79作用T细胞，发现：对照组抑制率为45. 7%，LPS组抑制率为64. 5%，Sj16多肽 NLS59 79不同剂量处理组分别为67. 3%，59. 6%，55. 7%。
[0030] 实施例4 选择质量18~21gC57小鼠，雌雄各10只，称取去除内毒素的Sjl6多肽NLS59 79 10g，用蒸馏水配制成50mL混悬液，按0.13mL/10g鼠重经口灌胃，每间隔3h灌胃小鼠，累 计2次灌胃总量达12g/kg(相当于人群推荐用量0.102g/kg的600倍)，灌胃前停食12 h，连续观察1周，并记录动物中毒症状及死亡情况，结果发现：1周内试验动物未见明显中 毒症状及死亡发生，采用霍恩法测定LD5。> 10g/kg。按急性经口毒性分级标准判定Sjl6 多肽NLS59 79蛋白属实际无毒级。
【主权项】
1. 一种生物免疫抑制剂，其特征在于，所述生物免疫抑制剂的活性成分是氨基酸序列 如SEQIDNO:1所示的蛋白。2. 根据权利要求1所述的生物免疫抑制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的辅剂。3. 根据权利要求2所述的生物免疫抑制剂，其特征在于，生物免疫抑制剂的剂型为散 剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、片剂或注射剂。 4. SEQIDNO:1所示的蛋白在制备免疫疾病治疗药物中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述免疫疾病是指自身免疫疾病。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述自身免疫疾病为免疫移植反应、月中 瘤、器官特异性自身免疫病、自身免疫性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肠炎、系统性红斑 狼疮、口眼干燥综合征、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎或韦格纳肉芽肿病。
【专利摘要】本发明属于生物制药技术领域，具体公开了一种生物免疫抑制剂，所述生物免疫抑制剂的活性成分是氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示的蛋白；所述蛋白具有高效的抗炎作用，能够抑制各种自身免疫疾病，且与各种宿主之间同源性较低，毒副作用较低，安全性较高；同时，该蛋白可与药学上可接受的辅剂搭配制备成药物，具有广阔的市场空间和较好的社会、经济效益。
【IPC分类】A61K38/17, A61P37/02, A61P25/00, A61P37/06, A61P35/00, A61P19/02
【公开号】CN105250992
【申请号】CN201510584501
【发明人】孙希, 杨帆, 吕志跃, 吴忠道
【申请人】中山大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月15日